多糖結構分析-

1、多糖結構研究方法多糖及其復合物是來自于高等動、植物細胞膜和微生物細胞壁中的天然大分子物質之一，自然界含量豐富，與人類生活緊密相關，對維持生命活動起至關重要的作用。多糖和核酸、蛋白質、脂類構成了最基本的4類生命物質。由于多糖的生物活性與多糖的結構關系密切，因此清楚認識多糖的結構是進行多糖研究和利用的基礎。多糖結構比蛋白質和核酸的結構更加復雜，可以說是自然界中最復雜的生物大分子。從化學觀點來看，多糖結構解析最大的難點就在于其結構的復雜性。糖的結構分類可沿用蛋白質和核酸的分類方法，即多糖的結構也可分為一級、二級、三級和四級結構。與蛋白質或核酸大分子相比，糖鏈的一級結構“含義”要十分豐富。測定糖鏈的一

2、級結構，要解決以下幾個問題：(1)相對分子質量；(2)糖鏈的糖基組成，各種單糖組成的摩爾比；(3)有無糖醛酸及具體的糖醛酸類型和比例；(4)各單糖殘基的D-或L構型，毗喃環(huán)或呋喃環(huán)形式；(5)各個單糖殘基之間的連接順序；(6)每個糖苷鍵所取的a-或B異頭異構形式；(7)每個糖殘基上羥基被取代情況：(8)糖鏈和非糖部分連接情況；(9)主鏈和支鏈連接位點：（10)糖殘基可能連接硫酸酯基、乙?；?、磷酸基、甲基的類型等。多糖的二級結構是指多糖主鏈間以氫鍵為主要次級鍵而形成的有規(guī)則的構象，與分子主鏈的構象有關，不涉及側鏈的空間排布；多糖的三級結構和四級結構是指以二級結構為基礎，由于糖單位之間的非共價相互

3、作用，導致二級結構在有序的空間里產(chǎn)生的有規(guī)則的構象四。多糖結構的分析手段很多。不僅有儀器分析法，如紅外、核磁共振、質譜等，還有化學方法，如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反應等，以及生物學方法，如特異性糖苷酶酶切、免疫學方法等。1質譜(MS)由于MS法在糖鏈結構分析中具有快速靈敏，樣品用量少、結構信息直觀的特點而得到越來越廣泛的應用。近年來各種軟電離技術的誕生，如快原子轟擊質譜(FABMS)，電噴霧質譜(ESIMS)，基質輔助激光解析離子化質譜(MALDI-MS)等，使得糖結構分析的研究取得了日新月異的發(fā)展。(1)快原子轟擊質譜(FABMS)FAB-MS是上世紀80年

4、代初發(fā)展起來的一種新的軟電離質譜技術。其顯著區(qū)別于傳統(tǒng)質譜之處在于樣品受加速原子或離子的轟擊，可直接在基質溶液中電離。FAB-MS的引入使傳統(tǒng)質譜技術難以分析的極性強，難揮發(fā)以及熱不穩(wěn)定的化合物不經(jīng)衍生化就可以直接進行質譜分析，而且對生物大分子的研究取得了重大突破。FAB-MS已被證明是分析糖結構最為有力的方法之一，它不僅可以測定寡糖及其衍生物的分子量，而且可以測定聚合度高于30的糖的分子量。同時，F(xiàn)AB-MS還可以確定糖鏈中糖殘基的連接位點和序列，已廣泛用于糖類的分析。(2)電噴霧質譜(ESI-MS)ESI-MS是將溶液中分子轉變成氣相離子非常有效的手段，是目前最軟的一種電離方式。這種電離方

5、式所產(chǎn)生的分子離子往往帶有多電荷。因此ESI-MS可以測定的分子量范圍大大擴展。對多糖而言，ESI-MS可以分析nh25個甚至更多單糖殘基組成的含有羧基或硫酸根等官能團的多糖。近年來，ESI-MS已在多糖的結構分析中顯示了強大的生命力。它能用于衍生化和非衍生化多糖的測定。ESI-MS易與HPLC，CE等技術聯(lián)用，大大提高了工作效率以及靈敏度和精確度，如ESI-MS與I-IPLC聯(lián)用分析寡糖及其衍生物。(3)基質輔助激光解析離子化質譜(MALDI-MS)MALDI-MS于上世紀80年代末問世。由于技術的特點，這種離子化方式電離出的離子常用飛行時間(TOF)檢測器檢測，因此MALDI-MS常與TO

6、F一起稱為基質輔助激光解析離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)。它也是一種軟電離方式，產(chǎn)生的分子離子十分穩(wěn)定，不易裂解，所以適用于檢測大分子質量的生物樣品。2紅外光譜(IR)紅外光譜(infrared spectroscopy，IR)是一種吸收光譜。因為紅外光只能激發(fā)分子內(nèi)原子核之間的振動和轉動能級的躍遷，所以紅外吸收光譜是通過測定振動和轉動能級躍遷的信息來研究分子結構的。在紅外光譜圖中，縱坐標一般用線性透光率作標度，稱為透射光譜圖；也有采用非線性吸光度為標度的，稱為吸收光譜圖。譜圖中的橫坐標是以紅外輻射光的波數(shù)(鋤d)為標度。較少采用波長(pm)為標度。波長和波數(shù)的關系依照式為：v

7、(cml)u岬)=104。紅外輻射光的波數(shù)可分為近紅外區(qū)(10000-4000cm-1)、中紅外區(qū)(4000-400cm-1)和遠紅外區(qū)(400-10 cnl-1)。其中最常用的是中紅外區(qū)，大多數(shù)化合物的化學鍵振動能級的躍遷發(fā)生在這一區(qū)域，因此主要研究中紅外區(qū)域的吸收光譜即分子的振動光譜，可以對各種高分子材料進行分析、測定。則對應這些基團的一些譜帶在這個化合物的取光譜中往往是最強的，明顯地顯示這個基團的結構特征。因此，對應這些基團的譜帶在其聚合物的譜圖中，常常是處于最顯著的地位，能夠很特征地反映該類聚合物的結構和預示其存在。對于各種聚合物分子來說，含有的主要極性基團是酸、酯、酰胺、酰亞胺、苯醚

8、、脂肪醚和醇等。除此之外，含有硅、硫、磷、氯和氟等雜原子的化合物也常具有較強的極性。紅外光譜作為“分子的指紋”廣泛用于分子結構和物質化學組成的研究。根據(jù)分子對紅外光吸收后得到譜帶頻率的位置、強度、形狀以及吸收譜帶和溫度、聚集狀態(tài)等的關系便可確定分子的空間構型，求出化學鍵的力常數(shù)、鍵長和鍵角。從光譜分析的角度看主要是利用特征吸收譜帶的頻率推斷分子中存在某一基團或鍵，由特征吸收譜帶頻率的變化推測臨近的基團或鍵，進而確定分子的化學結構，當然也可由特征吸收譜帶強度的改變對混合物及化合物進行定量分析。3拉曼光譜拉曼散射又稱拉曼效應，是由印度物理學家拉曼于1928年首先發(fā)現(xiàn)并因此獲得1930年諾貝爾物-理

9、獎。拉曼效應是能量為hvo的光子同分子碰撞所產(chǎn)生的光散射效應，也就是說，拉曼光譜是一種散射光譜。單色光束的入射光光子與分子相互作用時可發(fā)生彈性碰撞和非彈性碰撞，在非彈性碰撞過程中，光子與分子之間發(fā)生能量交換，光子不僅僅改變運動方向，同時光子的一部分能量傳遞給分子，或者分子的振動和轉動能量傳遞給光子，從而改變了光子的頻率。簡單來說，散射分子的轉動能級和振動能級發(fā)生了變化是產(chǎn)生拉曼散射的原因，此時散射光子頻率不同于入射光子。因此，每種物質的拉曼光譜也就是拉曼散射光譜都只與其自身的分子結構有關，而與入射光的頻率無關。拉曼效應普遍存在于一切分子中，無論是氣態(tài)，液態(tài)和固態(tài)。拉曼散射光譜對于樣品制備沒有特

10、殊要求；對于樣品數(shù)量要求比較少。拉曼散射最突出的優(yōu)點是采用光子探針，對于樣品無損傷探測，尤其適合對稀有或珍貴的樣品進行分析，甚至可以用拉曼光譜檢測活體中的生物物質。拉曼光譜與紅外光譜是相互補充的。在各種分子振動方式中，強力吸收紅外光的振動能產(chǎn)生高強度的紅外吸收峰，但只能產(chǎn)生強度較弱的拉曼譜峰；反之，能產(chǎn)生強的拉曼譜峰的分子振動卻產(chǎn)生較弱的紅外吸收峰。將兩者結合起來才能得到分子振動光譜的完整數(shù)據(jù)，更好地解決分子結構的分析問題。常用的拉曼光譜技術主要有：顯微共焦拉曼光譜技術、傅里葉變換拉曼光譜技術、共振增強拉曼光譜技術和表面增強拉曼光譜技術。(1)顯微共焦拉曼光譜技術顯微共焦拉曼光譜技術是將拉曼光

11、譜分析技術與顯微分析技術結合起來的一種應用技術。通過兩根光導纖維將顯微鏡與拉曼光譜儀組合起來，實驗時通過顯微鏡觀察，選擇有關分析所感興趣的待測樣品的部位，一根光導纖維將被激發(fā)的激光光束從光譜儀傳遞到顯微鏡待測樣品部位，入射激光通過顯微鏡聚焦后，照射到被測樣品上，另一根光導纖維將拉曼散射光輻射傳遞回光譜儀的有關部位，傳遞回來的拉曼散射光信號被相干儀所調整，形成光譜信號。顯微共焦拉曼光譜技術可在不受周圍成分干擾的情況下，精確獲取微區(qū)內(nèi)的化學信息，如化學成分、晶體結構、分子取向及分子間相互作用等。(2)傅里葉變換拉曼光譜技術傅里葉變換拉曼光譜一般采用波長1064nm的近紅外激光作為激發(fā)光源，分子的熒

12、光不被激發(fā)，避免了許多樣品拉曼光譜中的熒光干擾，近90的化合物可獲得拉曼光譜。(3)共振增強拉曼光譜技術當激發(fā)光的頻率接近或等于被測分子的電子吸收頻率(紫外可見光)時，某一條或幾條特定的拉曼線強度會急劇增加，甚至可以出現(xiàn)正常拉曼效應中觀察不到的泛頻及組合振動頻率的譜峰。共振拉曼光譜靈敏度高，可檢測低濃度和微量樣品，可研究大分子聚集體的局部結構，已成為研究有機分子、離子、生物大分子甚至活體組織的有利工具。(4)表面增強拉曼光譜技術表面增強拉曼光譜技術是一種新的表面測試技術，它可以在分子水平上研究材料分子的結構信息，具有極高的靈敏度和選擇性等獨特的優(yōu)點。4 X射線衍射(XRD)1912年德國物理學

13、家勞厄(Laue)等人根據(jù)理論預見，并用實驗證實了X射線具有波動性，它與晶體相遇時能產(chǎn)生衍射現(xiàn)象，并證明了X射線的波動性和晶體內(nèi)部結構的周期性，開創(chuàng)了x射線晶體學這一新領域。當一束單色x射線入射到晶體時，由于這些規(guī)則排列的原子間距離與入射X射線波長有相同數(shù)量級，故能相互干涉，在某些特殊方向上產(chǎn)生X射線衍射，衍射線在空間分布的方位和強度，與晶體結構相關。衍射線空問方位與晶體結構的關系可用布拉格(Bragg)方程表示：2dsin=n，式中d為晶面間距，為掠射角，n為反射級數(shù)，為x射線波長。5核磁共振(NMR)核磁基振(縮寫為NMR)，是指核磁矩不為零的核，在外磁場的作用振能提供有關化學結構及分子動

14、力學的信息，成為分子結構解析的一個有力工具。核磁共振技術于1946年美國哈佛大學的波賽爾和斯坦福大學的布洛赫發(fā)現(xiàn)的，經(jīng)過60多年的理論和技術上的發(fā)展，取得了非常驚人的成就，該領域已先后有6位科學家獲得4次諾貝爾獎?，F(xiàn)在核磁共振技術己經(jīng)廣泛應用于物理，化學，醫(yī)學，生物等多個領域。尤其是現(xiàn)在用多核，多維核磁共振方法進行的生物大分子(蛋白質、核酸等)的三維空間構象和動力學研究更加引人注目。近些年來，人們通過核磁共振或X射線晶體衍射技術解析了越來越多的蛋白質及其復合物的結構。通過對這些結構的分析，人們對生物大分子架構，酶作用的活性位點，蛋白質與蛋白質相互作用的界面等有了更深入的了解。但是，隨著了解的加

15、深，人們同時認識到僅僅對靜態(tài)結構的了解并不足以解釋蛋白質在生理過程中的作用機理。因為三維空間的結構僅僅是基態(tài)的結構，而在生理過程中蛋白質分子更多的處于激發(fā)態(tài)，并同蛋白質分子的運動特性密切相關。我們必須了解蛋白質分子結構隨時間的變化，從而在分子的靜態(tài)結構和動態(tài)結構間架起一座橋梁，這樣才能最終揭示蛋白質分子結構與功能的關系。6掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡簡稱為掃描電鏡，英文縮寫為SEM(ScanningElectron Microscope)。SEM與電子探針(EPMA)的功能和結構基本相同，但SEM一般不帶波譜儀(WDS)。它是用細聚焦的電子束轟擊樣品表面，通過電子與樣品相互作用產(chǎn)生的二次電子、

16、背散射電子等對樣品表面或斷口形貌進行觀察和分析。現(xiàn)在SEM都與能譜(EDS)組合，可以進行成分分析。所以，SEM也是顯微結構分析的主要儀器，已廣泛用于材料、冶金、礦物、生物學等領域。掃描電鏡主要包括電子光學系統(tǒng)、掃描系統(tǒng)、信號檢測放大系統(tǒng)、圖象顯示和記錄系統(tǒng)、電源和真空系統(tǒng)等。其工作原理(圖11)：在高電壓作用下，從電子槍射出來的電子束往聚光鏡和物鏡聚焦成很細的高能電子束，在掃描線圈的作用下，在試樣的表面進行幀掃描。電子束與試樣表面物質相互作用產(chǎn)生背散射電子，二次電子等各種信息，探測器將這些信號接受，經(jīng)放大器放大去調節(jié)顯像管的柵極，并在熒光屏上顯示出襯度。掃描電鏡的主要性能與特點：放大倍率高，

17、從幾十放大到幾十萬倍，連續(xù)可調。分辨率高、景深大、景深大，圖像立體感強，樣品通常不需要作任何處理即可以直接進行觀察，所以不會由于制樣原因而產(chǎn)生假象。這對斷口的失效分析特別重要。樣品制備簡單，可以是自然面、斷口、塊狀、粉體、反光及透光光片，對不導電的樣品只需蒸鍍一層20nm的導電膜。另外，現(xiàn)在許多SEM具有圖像處理和圖像分析功能。有的SEM加入附件后，能進行加熱、冷卻、拉伸及彎曲等動態(tài)過程的觀察。但掃描電鏡只能觀察物質表面的微觀形貌，無法獲得物質內(nèi)部的信息。7透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡是以波長很短的電子束做照明源，用電磁透鏡聚焦成像的一種具有高分辨本領，高放大倍數(shù)的電子光學儀器。測試的樣品要求

18、厚度極薄(幾十納米)，以便使電子束透過樣品。在真空條件下，電子束經(jīng)高壓加速后，穿透樣品時形成散射電子和透射電子，它們在電磁透鏡的作用下在熒光屏上成像。投射電子顯微鏡結構如圖12所示91。透射電子顯微術在高分子研究中有著重要的應用。它可用來觀察高分子晶體的形貌和結晶結構，高分子多相體系的微觀相分離結構，高分子材料的網(wǎng)絡，測定高分子的分子量分布和多孔高分子薄膜的微孔大小與分布，高分子材料的表面、界面和斷口、粘合劑的粘結效果以及聚合物涂料的成膜特性，還可用來使高分子晶體的晶格至高分子本身直接成像。透射電鏡由于入射電子透射試樣后，將與試樣內(nèi)部原子發(fā)生相互作用，從而改變其能量及運動方向。顯然，不同結構有不同的相互作用。這樣，就可以根據(jù)透射電子圖象所獲得的信息來了解試樣內(nèi)部的結構。由于試樣結構和相互作用的復雜性，因此所獲得的圖象也很復雜。它不象表面形貌那樣直觀、易懂。8差示掃描量熱法(DSC)DSC是在程序控制溫度條件下，測量輸入給樣品與參比物的功率差