醫(yī)學(xué)標(biāo)書范文3

1、醫(yī)學(xué)標(biāo)書范文3河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目申 請(qǐng) 書姓 名： jiangdongo 項(xiàng)目名稱： gfr4表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制的研究 單 位: 鄭州大學(xué) 聯(lián)系電話: 填 報(bào) 說 明 請(qǐng)根據(jù)自己的專業(yè)及研究方向，針對(duì)某具體臨床問題,結(jié)合所學(xué)習(xí)臨床科研方法的一種或幾種寫出一份科研設(shè)計(jì)。完成后,文件以個(gè)人姓名命名，發(fā)至:1736601711?？己顺煽円涝O(shè)計(jì)書優(yōu)略評(píng)定。截至日期21年11月8日。一、項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)和意義（說明國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)發(fā)展水平和趨勢等） 結(jié)直腸癌（oea cncer,cr）是起源于結(jié)直腸黏膜上皮的惡性腫瘤，是臨床最常見的惡性腫瘤之一。我國每年結(jié)直腸

2、癌新發(fā)病例超過25萬，死亡病例約14萬,新發(fā)與死亡病例均占全世界同期結(jié)直腸癌病例的。局部進(jìn)展期結(jié)直腸癌5年癌癥相關(guān)生存率為70%,而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期結(jié)直腸癌5年生存率僅為1%,且生活質(zhì)量低。目前結(jié)直腸癌新輔助化療、輔助化療、姑息化療方案很多，如ef、df、奧沙利鉑+氟尿嘧啶、順鉑+氟尿嘧啶等，但其最核心的藥物是氟尿嘧啶,在此基礎(chǔ)上聯(lián)合其他化療藥物。近年來,靶向藥物在結(jié)直腸癌治療領(lǐng)域的研究和應(yīng)用成為一大熱點(diǎn),作用于gfr的愛必妥、作用于veg的貝伐單抗、針對(duì)he-2的赫賽汀等已進(jìn)入胃癌治療的臨床實(shí)驗(yàn)中。 成纖維生長因子受體(f）是一個(gè)多基因家族,屬免疫球蛋白基因超家族成員，是分布在多種細(xì)胞上的

3、膜蛋白,fgfr家族成員有fgr1、fr2、fr3以及gr4。它們的特點(diǎn)是在胞膜外含有個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，一個(gè)疏水的跨膜結(jié)構(gòu)，胞漿內(nèi)含有兩個(gè)呈串聯(lián)結(jié)構(gòu)的酪氨酸激酶功能區(qū)。fgfr1在體內(nèi)是廣泛分布的,而fgfr主要在發(fā)育早期大量表達(dá),而且主要分布在視網(wǎng)膜和腎臟。編碼ff4蛋白的fgr4基因位于5號(hào)染色體,5q35.1ter，基因編號(hào)為2264。g蛋白是一類具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受體中的一種,在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和血管形成等進(jìn)程中起著十分重要的作用2,3。但gfr4在惡性腫瘤中的研究相對(duì)較少,ubd檢索該分子在胃癌中的研究僅見幾篇報(bào)道,而且研究尚不深入。但有學(xué)者認(rèn)為，fgr家族是在

4、惡性腫瘤診治方面是一個(gè)新興的領(lǐng)域，有廣闊的應(yīng)用前景4。fgfr4在常見的惡性腫瘤如乳腺癌、胰腺癌、橫紋肌肉瘤及腎細(xì)胞癌中均呈高表達(dá)5-7。mi d等報(bào)道fgfr4表達(dá)是復(fù)發(fā)性乳腺癌患者的獨(dú)立的預(yù)后因素8;ino等研究亦認(rèn)為fgfr4可以預(yù)測三苯氧胺治療乳腺癌的療效9。goadan等10 研究報(bào)道,與良性增生相比,gfr4在前列腺癌中的表達(dá)顯著上調(diào);fg的表達(dá)與geason評(píng)分相關(guān);生存分析顯示，fgfr4過表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān),無病生存期縮短。ho hk等對(duì)57對(duì)肝細(xì)胞肝癌組織及對(duì)應(yīng)的正常組織進(jìn)行eal tiepcr定量檢測fgf4在mrna水平的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，fgfr4的表達(dá)與患者的主

5、要臨床病理資料無相關(guān)性,可能是由于樣本量較小11。steit等12通過免疫組化技術(shù)對(duì)37例惡性黑色素瘤組織標(biāo)本進(jìn)行g(shù)f4蛋白水平表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示,fr4在惡性黑色素瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)率為5，fgfr4的表達(dá)與腫瘤臨床分期、微潰瘍形成、原發(fā)灶的數(shù)目、總生存期及無病生存期均有明顯相關(guān)性,作者認(rèn)為fgfr4蛋白的表達(dá)可作為惡性黑色素瘤進(jìn)展的潛在指標(biāo)。自2002年,bange等13發(fā)現(xiàn)了fgf g88arg這一胚系多態(tài)性后，該sn現(xiàn)已成為了一個(gè)研究的熱點(diǎn)。該s是位于gfr4第9外顯子388密碼子上，堿基g轉(zhuǎn)變?yōu)閍，導(dǎo)致了ffr4的氨基酸序列發(fā)生了變化,即38位氨基酸由甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榫彼?該位點(diǎn)位

6、于fgf4的高度保守序列中。據(jù)報(bào)道,fr4 arg388基因型并不影響腫瘤的發(fā)生過程，因?yàn)樵谌橄侔┗颊呒罢?duì)照中，該sn在兩組中的分布比例大致相同,gr4 arg38基因型均占50%左右。但在淋巴結(jié)陽性的乳腺癌患者中,fgf4 g38基因型與更短的無病生存期和總生存期有關(guān)14。有報(bào)道顯示，攜帶有ar38等位基因的肺癌患者腫瘤發(fā)病年齡更早,差的臨床分期的比例更高,生存期更短,所以fgfr4gy88ar可能預(yù)測肺癌的預(yù)后15。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了該snp位點(diǎn)具有臨床意義,這一推斷已在頭頸部癌、前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤中得以證實(shí)3, 16-18。當(dāng)然也有一些文獻(xiàn)認(rèn)為該snp無預(yù)后價(jià)值。近來,一項(xiàng)隨機(jī)的i

7、i期實(shí)驗(yàn)研究中，257例t24/n02/原發(fā)性乳腺癌患者接受了阿霉素和環(huán)磷酰胺(ac)或阿霉素和培美曲唑(a）,序貫多西他賽（doc)作為新輔助化療，多因素分析顯示,fgfr4 38是ac-doc作為乳腺癌患者新輔助治療方案病理性完全緩解的獨(dú)立預(yù)后因素19。suiyam等發(fā)現(xiàn)了mt1-m/fgfr4這個(gè)復(fù)合物，其中fr4 r388等位基因可通過減少溶酶體對(duì)mt1-mmp的降解而增加對(duì)膠原蛋白的侵襲;通過sirna下調(diào)mt1-mmp或gfr4-r88均可阻止細(xì)胞侵襲和生長20。近來一項(xiàng)meta分析顯示,fgr4gly88arg多態(tài)性與前列腺癌的進(jìn)展相關(guān),可作為前列腺癌的進(jìn)展的一個(gè)分子標(biāo)記21。在

8、目前發(fā)現(xiàn)的2余種成纖維生長因子(fgf）中，能與fgfr結(jié)合的生長因子有ff1, 2, 4, 6， 8, 9, 16, 17,18 和 。其中只有fgf1僅對(duì)fgfr特異性結(jié)合22。且無論有無kltho存在，fgf1均可與fgf4結(jié)合而引起后續(xù)的生物學(xué)效應(yīng)2。ff的激活是f9促進(jìn)肝細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)肝癌形成的機(jī)制24fgfr4在在結(jié)直腸癌中的研究甚少,故而本課題重點(diǎn)探討了fgr4的表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株的生物學(xué)行為的影響及作用機(jī)制。本研究為了解fgfr對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響，進(jìn)行了體外功能實(shí)驗(yàn)，通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)gfr的表達(dá),然后進(jìn)行了一系列功能實(shí)驗(yàn),包括增殖實(shí)驗(yàn)、克隆實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、

9、劃痕實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期的變化，western bo檢測凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白在干擾前后的變化,初步探討fgr4影響結(jié)直腸癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的機(jī)制。1.nterntonal ageny fr esearch n ace. wordhalthoranzation loboan 2012： timated aner incidence,ortalty an revlenc wldide in 201b/o 2-15.2. swaakumar vp, lai， slssingr cellula ignal y brobatrowthfactr eceptorsytokine gr

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20、fgf19variantdenotmrveglucosmetabiminob/bmiceproceedingsofthnaionalacademyfscincofteunitedsatesofmeria0;06:437984.2. xinle,hongfei e，bryan lemn, et al.ff19-ndced hpacyte rolifeation i medaedhrogh fgf4 ativatio. ornl fboloical cheisty201; 25:516-70.二、項(xiàng)目創(chuàng)新點(diǎn)、主要研究開發(fā)內(nèi)容及目標(biāo)（實(shí)施方案、技術(shù)關(guān)鍵、技術(shù)路線和技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)等)1.實(shí)施方案(）設(shè)計(jì)

21、4個(gè)fgfr4rna靶點(diǎn)構(gòu)建到慢病毒載體，進(jìn)而小量包裝秤病毒顆粒。然后感染s20和ct1結(jié)直腸癌,通過定量c和western blot法檢測fgfr4在mn和蛋白水平的表達(dá),篩選出干擾效果最佳的sirna,進(jìn)行大量包裝，形成fgfr4sir穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,fgfr4持續(xù)低表達(dá)；構(gòu)建fgr4過表達(dá)慢病毒載體，進(jìn)而包裝成病毒顆粒, 然后感染結(jié)直腸癌細(xì)胞株，形成gfr4 過表達(dá)細(xì)胞株，gfr4持續(xù)高表達(dá),以備后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。2. 對(duì)fgr4 sira穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和fgr過表達(dá)細(xì)胞株，分別以各自未行處理的細(xì)胞株作為對(duì)照,進(jìn)行一系列的體外功能實(shí)驗(yàn),以評(píng)價(jià)fgfr4的上調(diào)和下調(diào)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

22、,包括增殖實(shí)驗(yàn)、克隆實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期的變化；同時(shí)在分子水平進(jìn)行estern blo檢測,以顯示不同處理后,細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的變化,如mp-2、p27、cld1及bcl-xl等。. 分別將ff sin穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株、fgfr4過表達(dá)細(xì)胞株和相應(yīng)的未處理的結(jié)直腸癌細(xì)胞株皮下注射至裸小鼠（n/nu)背部, 構(gòu)建成裸小鼠結(jié)直腸癌模型。接種8周后,觀測不同處理組成瘤體積、大小等增殖指標(biāo)的變化;對(duì)裸小鼠結(jié)直腸癌組織行免疫組化檢測，以了解不同處理組腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性相關(guān)分子表達(dá)的變化。2.研究方法和研究手段：1.標(biāo)本來源:結(jié)直腸癌細(xì)胞株hct1、s62、d1、sw16

23、、4等均購自上海中科院細(xì)胞所或atcc,按說明書培養(yǎng),利用dmem培養(yǎng)基、gibio美洲胎牛血清、100um青霉素及0ug/m鏈霉素等培養(yǎng)細(xì)胞。bal/c(u-u)裸小鼠擬購自中國科學(xué)院上海藥物研究所，合格證編號(hào):滬動(dòng)合證字122號(hào)；日齡：-3天；體重16-20；飼養(yǎng)于sf級(jí)環(huán)境中。用于ff ni和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)的慢病毒載體擬購自上?；鶆P公司。2利用軟件設(shè)計(jì)-4個(gè)fr4 rn靶點(diǎn)，構(gòu)建到慢病毒載體上，進(jìn)而包裝成病毒顆粒，然后感染fgfr4高表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞株，經(jīng)t-c和esterbot驗(yàn)證干擾效率，制備成ffr4rni穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。同樣,運(yùn)用慢病毒載體構(gòu)建ff4過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株。.利用流式細(xì)胞

24、儀、cck-8及侵襲小室等對(duì)fgfr ni穩(wěn)轉(zhuǎn)株和fr4過表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn)，包括增殖實(shí)驗(yàn)、克隆實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期的變化;同時(shí)在分子水平進(jìn)行ten blt檢測結(jié)直腸癌生物特性相關(guān)分子表達(dá)的變化。4.將gfr4 rna穩(wěn)轉(zhuǎn)株、ff過表達(dá)細(xì)胞株及相應(yīng)的未感染細(xì)胞株分別皮下注射入裸小鼠背部，構(gòu)建成裸鼠結(jié)直腸癌模型，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。觀測成瘤體積等細(xì)胞增殖指標(biāo)，利用免疫組化技術(shù)檢測fgfr不同表達(dá)的裸鼠結(jié)直腸癌模型相關(guān)分子表達(dá)的變化。.技術(shù)路線見圖一有效靶點(diǎn)大量包裝設(shè)計(jì)4個(gè)fgfr4基因rnai靶點(diǎn)構(gòu)建到慢病毒載體載體小量包裝慢病毒顆粒感染hct116、sw620結(jié)直腸癌細(xì)胞株fg

25、fr4mrna和蛋白質(zhì)的表達(dá)干擾效率滿意fgfr4基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建過表達(dá)載體小量包裝慢病毒顆粒感染結(jié)直腸癌細(xì)胞株fgfr4mrna和蛋白的表達(dá)qpcr和westernblotfgfr4過表達(dá)滿意基因功能研究成瘤的體積、大小等增值指標(biāo)的評(píng)價(jià)腫瘤組織mmp-2、p27、cyclind1、bcl-xl表達(dá)的變化mmp-2、p27、cyclind1、bcl-xl表達(dá)的變化增值、侵襲、凋亡、細(xì)胞周期變化等試驗(yàn)in vivoin vitro裸鼠結(jié)直腸癌模型的構(gòu)建 圖一4.技術(shù)關(guān)鍵本課題關(guān)鍵技術(shù)在于fgfr4 rna慢病毒載體的構(gòu)建及gfr4 rai穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株的建立;fgfr過表達(dá)慢病毒載體

26、的構(gòu)建及fgr4過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株的建立;g4不同表達(dá)的裸小鼠結(jié)直腸癌模型的構(gòu)建；一系列體外功能實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)及相關(guān)分子檢測，探討fgf4在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用三、實(shí)施本項(xiàng)目已具備的條件(說明已具備的試驗(yàn)手段、技術(shù)力量、前期科研基礎(chǔ)情況）（1)本課題申請(qǐng)人可獨(dú)立進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)操作主要包括:新鮮標(biāo)本na和rn的抽提和測定；rtpr及reltmepr的操作和結(jié)果分析;免疫組化技術(shù)的操作和結(jié)果分析；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù);蛋白抽提、濃度測定、wese lo檢測靶分子蛋白表達(dá)及結(jié)果分析;srn瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)及轉(zhuǎn)染效率測定;cck-法檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)的檢測,細(xì)胞免疫熒光技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室老師協(xié)助下完成。

27、(）.慢病毒構(gòu)建rni載體及過表達(dá)載體,是一些非常成熟的技術(shù)，fgfr4 rnai穩(wěn)轉(zhuǎn)株和fgfr過表達(dá)細(xì)胞株的建立可請(qǐng)上海吉?jiǎng)P公司協(xié)助完成,而該公司為專業(yè)從事介導(dǎo)靶分子上調(diào)和下調(diào)病毒載體的制備和包裝,已和前期研究所在實(shí)驗(yàn)室有過多次成功合作先例；而構(gòu)建裸小鼠腫瘤模型亦是一項(xiàng)常用的研究技術(shù)，可請(qǐng)相關(guān)老師指導(dǎo)完成。(3）本課題在葉延偉老師的帶領(lǐng)下進(jìn)行,葉老師在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院攻讀腫瘤學(xué)博士學(xué)位,期間在復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中心進(jìn)行了為期年的博士課題實(shí)驗(yàn)部分的研究,獨(dú)立完成了一系列實(shí)驗(yàn)操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)發(fā)表。碩博連讀期間以第一作者發(fā)表sci論著篇,最高if為5.13分，累計(jì)if達(dá)18分，分別發(fā)表于ca

28、ncr、cancr lters、anls srgcal ology、joural of surgial oncoogy、istiv surger;此外，以共同作者發(fā)表國內(nèi)外論著0余篇。鄭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室韓超老師給予實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的幫助，韓老師是鄭州大學(xué)的在職博士,實(shí)驗(yàn)技術(shù)精湛，經(jīng)驗(yàn)豐富。(4）.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)設(shè)備齊全，各個(gè)實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域均有專業(yè)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)員,為該研究順利實(shí)施提供了很好的平臺(tái)。四、項(xiàng)目的預(yù)期經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和環(huán)境效益fgfr4在結(jié)直腸癌中的研究很少，而且不夠深入。本課題利用慢病毒載體構(gòu)建fg4rai穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株和fgr4過表達(dá)細(xì)胞株，分別下調(diào)和上調(diào)ffr4分

29、子的表達(dá),進(jìn)行一系列的體內(nèi)和體外功能實(shí)驗(yàn),從而更全面、多角度地闡述f4在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為結(jié)直腸癌新的治療靶點(diǎn)的篩選提供一些依據(jù)，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見相關(guān)報(bào)道。五、項(xiàng)目實(shí)施的計(jì)劃進(jìn)度1 016年1月-2016年月：1)結(jié)直腸癌細(xì)胞株的培養(yǎng),包括ht11、sw及其他常見結(jié)直腸癌細(xì)胞株；篩選出fr4高表達(dá)和低表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株。2) fgfr4 rnai慢病毒載體的構(gòu)建與包裝，結(jié)直腸癌細(xì)胞株sw620、h16的感染, qcr和este blo反復(fù)檢測fgr4 rai慢病毒感染的效率，制備ffr4rai穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株。3)fgfr4過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建與包裝，慢病毒顆粒感染fgfr4低表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株,制備fgfr4過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株。2. 2016年月-2016年2月:）以fgfrni穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株、fr4過表達(dá)結(jié)直腸癌細(xì)胞株和各自的未感染細(xì)胞株為研究對(duì)象,進(jìn)行一系列的體外功能實(shí)驗(yàn)。）利用cck-8法進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)，克隆實(shí)驗(yàn)，trnswell小室行侵襲實(shí)驗(yàn),劃痕實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡和細(xì)胞株其分布的變化。3)利用weser bl法檢測不同細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)