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1、引物延伸分析(primer extension analysis)主要用于mRNA 5端作圖。poly(A)+RNA首先與過(guò)量5端標(biāo)記的且與靶RNA互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸引物雜交,然后用反轉(zhuǎn)錄酶延伸這個(gè)引物。產(chǎn)生的cDNA與RNA模板互補(bǔ)且長(zhǎng)度與引物5端和RNA 5端之間的距離相等。該法在mRNA 5端作圖方面具有下述優(yōu)勢(shì):一旦引物被子起始合成,延伸反應(yīng)大多會(huì)進(jìn)行到RNA模板的5最末端,產(chǎn)物大小可精確測(cè)定。此外,產(chǎn)物長(zhǎng)度不會(huì)受靶基因內(nèi)含子分布與大小的影響。幾乎所有的引物延伸實(shí)驗(yàn)多采用長(zhǎng)2030 bp合成寡核苷酸引物。當(dāng)用于和靶序列雜交的寡核苷酸引物位于距mRNA 5端150 bp以內(nèi)時(shí),可獲得最佳

2、結(jié)果。在更遠(yuǎn)距離處雜交的引物能增加異源延伸產(chǎn)物,因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄酶會(huì)在模板RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜區(qū)終止。因此,在設(shè)計(jì)引物時(shí),除實(shí)際的序列之外還應(yīng)考慮到雜交的位置。應(yīng)盡可能使寡核苷酸的GC含量在50%左右且在3端為G或C。用兩個(gè)引物在mRNA相距一段已知距離(2050 bp)的區(qū)域上分別雜交則更為理想。大小差別等于兩個(gè)引物間距的延伸產(chǎn)物,可對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。為了找到一對(duì)能產(chǎn)生明確延伸產(chǎn)物的引物,合成多個(gè)引物也許是必須的。在很多情況下,引物延伸反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)產(chǎn)物:全長(zhǎng)cDNA分子和短22 bp的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。這可能代表著多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)導(dǎo)致的mRNA 5端不均一性。有時(shí),在臨近靶mRNA 加帽位點(diǎn)的甲基化殘基

3、處的提前終止將產(chǎn)生更短的產(chǎn)物。與帽子結(jié)構(gòu)相關(guān)的條帶在不同mRNA 樣品中的化學(xué)定量是不同的,對(duì)于一份給定樣品總是一個(gè)定值。為了區(qū)分反轉(zhuǎn)錄假象和真正的mRNA 5端不均一性,用5端標(biāo)記的探針進(jìn)行S1核酸酶分析是一個(gè)很好的方法。與未進(jìn)一步分離的哺乳動(dòng)物RNA相比,poly(A)+RNA樣品可得到干凈得多的結(jié)果,因?yàn)榍罢叻之a(chǎn)生多到不可接受的提前終止產(chǎn)物。通過(guò)在更高濃度(5 mmol/l)dNTP下進(jìn)行延伸反應(yīng),并在用互補(bǔ)區(qū)位于mRNA 5端50100 bp以內(nèi)的引物可將假象降至最低。用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化寡核苷酸引物一度是必須的。這些年來(lái),除非總是產(chǎn)生延伸產(chǎn)物的梯狀條帶,許多研究者已不再費(fèi)心純化了

4、。在雜交反應(yīng)中,核苷酸引物分子的量應(yīng)大約10倍于靶mRNA。更多量的引物可能會(huì)導(dǎo)致非特異延伸和人為條帶的出現(xiàn)。所以,且一定量RNA與不同量的引物(通常為2040 fmol,104105 cpm)進(jìn)行一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)是可取的。復(fù)性溫度極大地影響引物延伸實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量,值得在預(yù)實(shí)驗(yàn)中調(diào)查以確定最佳復(fù)性溫度。多數(shù)情況下,對(duì)于GC含量為50%,2030 bp的引物,其最佳復(fù)性溫度在4060之間??梢栽O(shè)置一系列以5為間隔的引物延伸反應(yīng)來(lái)確定最佳復(fù)性溫度。當(dāng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析延伸產(chǎn)物時(shí),大小已知、末端標(biāo)記的DNA片段可用作相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記參照物。但最好是采用與延伸反應(yīng)相同引物的基于DNA模板的測(cè)序圖,通過(guò)對(duì)

5、照測(cè)序圖讀出引物延伸反應(yīng)產(chǎn)物的大小,靶RNA的5端可定位于一個(gè)特定的堿基。在研究啟動(dòng)子區(qū)時(shí)往往采用引物延伸分析(primer extension analysis,看了些相關(guān)資料,感覺(jué)收獲不小,和大家分享一下。1、引物延伸分析(primer extension analysis)引物延伸分析用于定量mRNA的量,測(cè)定低豐度的mRNA的種類。另外引物延伸實(shí)驗(yàn)可標(biāo)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5-端, 確定轉(zhuǎn)錄的精確起始。特異的末端標(biāo)記的引物退火到RNA鏈的互補(bǔ)區(qū)域,隨后用RNA作為模板,用反轉(zhuǎn)錄酶延伸引物得到cDNA,用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析cDNA。cDNA的長(zhǎng)度為引物的標(biāo)記的核苷酸到RNA-5末端間的堿基

6、數(shù),所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA, 長(zhǎng)度為20-40個(gè)核苷酸,與要分析的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5末端區(qū)域互補(bǔ)。延伸產(chǎn)物小于150個(gè)核苷酸,可得到最佳分離效果。引物延伸實(shí)驗(yàn)非常靈敏,可檢測(cè)2 pg的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,這相當(dāng)于1個(gè)細(xì)胞中的1個(gè)RNA。引物延伸實(shí)驗(yàn)非常適合于對(duì)單個(gè)基因作定量和定性分析。(1)引物延伸分析所用試劑:引物延伸實(shí)驗(yàn)需要模板RNA,可用總RNA或poly(A)+RNA。一個(gè)特異的末端標(biāo)記的核苷酸或DNA片段作為引物,用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。除RNA模板和標(biāo)記的引物,還需要反轉(zhuǎn)錄酶,AMV或MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、反應(yīng)溶液、脫氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝膠試劑,和電泳裝置

7、。所得結(jié)果用放射自顯影和磷成像儀分析。 (2)引物延伸系統(tǒng)的組分:引物延伸系統(tǒng)中AMV反轉(zhuǎn)錄酶和反應(yīng)溶液、焦磷酸鈉、正對(duì)照RNA模版和對(duì)照引物、去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子參照物、T4多核苷酸激酶和溶液、樣品溶液、AMV反轉(zhuǎn)錄酶2X溶液100 mM Tris-HCl(pH8.3, 42)、100 mM KCl、 20 mM MgCl2、20 mM DTT、2 mM每一種dNTP、1 mM精胺。PhiX174標(biāo)準(zhǔn)分子參照物和T4 多核苷酸激酶用作引物標(biāo)記,和確定延伸產(chǎn)物長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照RNA可得到87個(gè)堿基的延伸產(chǎn)物作為正對(duì)照。引物延伸反應(yīng)中用焦磷酸鈉和精胺可增加全長(zhǎng)cD

8、NA的得率,抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)。雖然其作用方式未確定,但結(jié)果是增加全長(zhǎng)cDNA的得率,抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)。MMLV被焦磷酸鈉和精胺抑制,如使用MMLV,放線菌素D可用于增加全長(zhǎng)cDNA的得率,抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)。焦磷酸鈉和放線菌素D抑制cDNA第二條鏈的合成。 (3)引物延伸實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化:雜交溫度。引物延伸實(shí)驗(yàn)中所用的雜交溫度是最關(guān)鍵的需優(yōu)化的因素。一般而言,最高緊密度,或引物和互補(bǔ)序列完全雜交所需的最適條件是,低于引物溶解溫度的5oC。低于最高緊密度的溫度可極大地增加雜交速度。應(yīng)在不同的緊密度的雜交溫度下作雜交,以控制引物和特異RNA的雜交。增加雜交緊密度時(shí),帶來(lái)的延伸

9、產(chǎn)物的丟失表明,引物和相關(guān)的卻不是等同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交。在堿和雙價(jià)陰離子的存在下,RNA在較高溫度會(huì)降解,應(yīng)用甲酰胺雜交操作方案,這可有效降低溶解溫度,因此可使雜交在較低的溫度進(jìn)行??稍陔s交步驟中用以下的溶液:40mMPIPES、1mMEDTA、0.4mM NaCl、80%的甲酰胺。如用這個(gè)雜交溶液,延伸步驟前甲酰胺和鹽需用乙醇沉淀后除去。模板RNA和引物的量。以下討論了所用RNA模板和引物的起始量。反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)不同模板使用的效率不同。這部分是由于RNA中存在的次級(jí)結(jié)構(gòu)干擾反轉(zhuǎn)錄酶的聚合酶活力。如產(chǎn)生短的產(chǎn)物,這通常不是一個(gè)問(wèn)題。如用AMV反轉(zhuǎn)錄酶,延伸溫度可達(dá)55。每次反應(yīng)所用RNA的量。每次反

10、應(yīng)所用RNA和引物的量取決于分析的RNA的種類(總RNA或poly(A) + RNA),目的RNA的相對(duì)豐度。如用總RNA,起始量為10ug,但分析稀有信號(hào),每次反應(yīng)用100 ugRNA。poly(A)+RNA每次反應(yīng)用0.1-1.0 ug,具體決定于總RNA中poly(A)+RNA的富含量,需分析的特異RNA的濃度。在引物延伸分析前需檢查目的RNA的完整。通過(guò)凝膠分析總RNA,應(yīng)有完整的18S和28S核糖體RNA帶。在引物延伸反應(yīng)中用Northern印跡和RT-PCR分析來(lái)確定特定RNA的存在。 每次反應(yīng)所用引物的量。用引物延伸實(shí)驗(yàn)定量RNA,標(biāo)記的引物必須多于目的RNA。引物應(yīng)是互補(bǔ)RNA

11、的5-10倍。但一般,總RNA或poly(A)+RNA中,特定目的RNA量未知。對(duì)未分析的轉(zhuǎn)錄物,初次分析用50 ug總RNA和100fmol引物。如所有RNA中與引物互補(bǔ)的位點(diǎn)飽和,測(cè)試信號(hào)和投入的RNA的量成正比,而不依賴于引物的濃度。引物應(yīng)至少為20個(gè)核苷酸,雜交位點(diǎn)應(yīng)位于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5-末端下游的100個(gè)堿基處,而不會(huì)自互補(bǔ)。也可用從限制性酶切片段所得的ssDNA作為探針,長(zhǎng)度應(yīng)不長(zhǎng)于50-100個(gè)核苷酸,以獲得最佳分辨率。AMV和MMLV的選擇。引物延伸反應(yīng)通常用AMV,AMV性能更好,對(duì)次級(jí)結(jié)構(gòu)耐受。用AMV的延伸溫度可達(dá)55, 以消除次級(jí)結(jié)構(gòu),但在這樣溫度下,引物延伸反應(yīng)的得率通常降

12、低。MMLV的最適溫度為37,在更高溫度下,MMLV不穩(wěn)定,但MMLV可合成更長(zhǎng)的產(chǎn)物,這一特點(diǎn)對(duì)引物延伸反應(yīng)不適用,因引物延伸反應(yīng)所得的產(chǎn)物一般較短,為100-500個(gè)核苷酸。會(huì)導(dǎo)致非特異,短的和多個(gè)引物延伸產(chǎn)物的影響因子:所研究的轉(zhuǎn)錄的差異程度可導(dǎo)致產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的延伸產(chǎn)物,它們來(lái)源于選擇式剪切和使用不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。差異核RNA的存在也能導(dǎo)致產(chǎn)生多個(gè)延伸產(chǎn)物。引物和RNA中相關(guān)或無(wú)關(guān)序列的交叉雜交也會(huì)導(dǎo)致非特異延伸產(chǎn)物的產(chǎn)生。產(chǎn)物短于預(yù)測(cè)可能和RNA模板的降解有關(guān),或者是轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中次級(jí)結(jié)構(gòu)阻制了反轉(zhuǎn)錄酶的合成,產(chǎn)生斷缺的cDNA。RNA樣品中存在DNA污染同樣可得延伸產(chǎn)物,加放線菌素D(

13、75ug/ml)可抑制這類產(chǎn)物的產(chǎn)生。應(yīng)作無(wú)RNA模板的負(fù)對(duì)照實(shí)驗(yàn),以確定所用試劑中無(wú)RNA和DNA污染。同時(shí)還應(yīng)用從不表達(dá)目的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的細(xì)胞或組織中提取的RNA模板作負(fù)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。 (4)計(jì)算RNA轉(zhuǎn)化為cDNA的量。RNA轉(zhuǎn)化為cDNA的量可對(duì)引物延伸產(chǎn)物,和無(wú)RNA對(duì)照實(shí)驗(yàn)的cpm作測(cè)量得到。從凝膠中分別切割引物延伸產(chǎn)物和無(wú)RNA對(duì)照實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)物,在閃爍液中測(cè)定凝膠塊的讀數(shù),可有效平衡聚丙烯酰胺凝膠的湮滅和32P的衰退。以下的例子表明如何計(jì)算fmol的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA,在這個(gè)例子中,一半的引物延伸產(chǎn)物(20ul/40ul)加入凝膠中作分析。無(wú)RNA對(duì)照實(shí)驗(yàn)的引物濃度為100 fmol,一

14、半的反應(yīng)液加入凝膠中作分析。切割的帶的讀數(shù)為:樣品為3912 cpm,引物為 cpm,首先計(jì)算引物cpm/ fmol:cpm/ fmol= cpm/100 fmolX(20/40)=2847 cpm/ fmol,接下來(lái)計(jì)算引物延伸產(chǎn)物的fmol,或cDNA:3912 cpm/2847 fmolX(20/40)=2.75 fmol cDNA。所得值表明引物延伸中所得的cDNA的量。 (5)確定引物延伸產(chǎn)物的精確長(zhǎng)度的分子標(biāo)準(zhǔn)參照物。為確定引物延伸產(chǎn)物的精確長(zhǎng)度,應(yīng)同同位素標(biāo)記的DNA分子標(biāo)準(zhǔn)參照物對(duì)照。DNA分子標(biāo)準(zhǔn)參照物末端作了標(biāo)記,上變性凝膠前先作變性,引物延伸產(chǎn)物也作變性。長(zhǎng)度在20-50

15、0核苷酸范圍的分子標(biāo)準(zhǔn)參照物在確定引物延伸產(chǎn)物的長(zhǎng)度方面很有用。去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子參照物非常方便,已去磷酸,可作5末端標(biāo)記,分子標(biāo)準(zhǔn)參照物的長(zhǎng)度為24-726核苷酸。用于引物延伸產(chǎn)物分離的聚丙烯凝膠的規(guī)格為16X18cm, 含8%聚丙烯、7M尿素、1TBE溶液。這種膠和測(cè)序膠很相似,故一般可用測(cè)序膠。應(yīng)注意不使引物延伸產(chǎn)物和自由引物跑到膠外,特別是需對(duì)cDNA定量時(shí)。2、核酸酶S1作圖(Mapping RNA with Nuclease S1)三種不同的核酸酶S1核酸酶、RNA酶、外切核酸酶VII被用來(lái)進(jìn)行RNA定量,確定內(nèi)含子位置,及鑒定在的DNA模板上mRNA的5-末端和3-末端的位置。含有目的mRNA的RNA樣品與互補(bǔ)的DNA或RNA探針在利

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