堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病

1、堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病田雪品，劉海英(承德市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北省承德市 )引用本文：田雪品，劉海英. 堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病J.中國組織工程研究，2016，20(36):5385-5391.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.010 ORCID: 0000-0002-5123-9594(田雪品)文章快速閱讀：堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病大鼠田雪品，女，1980年生，河北省承德市人，漢族，2015年河北醫(yī)科大學(xué)

2、畢業(yè)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌研究。中圖分類號:R394.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼:B文章編號:2095-4344(2016)36-05385-07稿件接受：2016-07-12糖尿病組靜脈注射PBS檢測指標(biāo)：(1)大鼠胰島組織中基質(zhì)金屬蛋白酶的mRNA表達(dá)；(2)移植后24 h，3 d，7 d，14 d，21 d大鼠血糖水平；(3)大鼠血漿胰島素分泌水平；(4)大鼠胰腺組織病理變化移植組靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液正常對照組建立大鼠糖尿病模型基因轉(zhuǎn)染組靜脈注射等量轉(zhuǎn)染PEGFP-C3-BFGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液 文題釋義：轉(zhuǎn)染：DNA小片段插入體細(xì)胞或細(xì)胞系的過程。若此DNA未與宿主細(xì)胞DNA

3、整合而獲表達(dá)，稱“瞬時轉(zhuǎn)染(transient transfection)”；若與宿主細(xì)胞DNA整合并隨后者的復(fù)制而復(fù)制稱“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stable transfection)”。胰島素抵抗：是指各種原因使胰島素促進(jìn)葡萄糖攝取和利用的效率下降，機(jī)體代償性的分泌過多胰島素產(chǎn)生高胰島素血癥，以維持血糖的穩(wěn)定。胰島素抵抗易導(dǎo)致代謝綜合征和2型糖尿病。20世紀(jì)50年代Yallow等應(yīng)用放射免疫分析技術(shù)測定血漿胰島素濃度，發(fā)現(xiàn)血漿胰島素水平較低的病人胰島素敏感性較高，而血漿胰島素較高的人對胰島素不敏感，由此提出了胰島素抵抗的概念。摘要背景：研究證實骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以明顯提高糖尿病大鼠胰島功能恢復(fù)及改善高

4、血糖狀態(tài)，可能與自體胰腺干細(xì)胞分化能力增強(qiáng)有關(guān)。目的：驗證堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因真核表達(dá)載體(PEGFP-C3-BFGF)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并移植入糖尿病大鼠體內(nèi)后，對大鼠糖尿病的治療效果。方法：通過重組腺病毒(Ad.aFGF)介導(dǎo)PEGFP-C3-BFGF轉(zhuǎn)染入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用熒光顯微鏡觀察PEGFP-C3-BFGF的表達(dá)。將80只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、糖尿病組、移植組及基因轉(zhuǎn)染組，每組20只，采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立大鼠糖尿病模型，模型建立后于對照組給予門靜脈注射生理鹽水，糖尿病組門靜脈注射PBS液，移植組門靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液1 mL，基因轉(zhuǎn)染組門靜

5、脈注射等量轉(zhuǎn)染PEGFP-C3-BFGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液。利用RT-PCR法檢測各組大鼠胰島組織中基質(zhì)金屬蛋白酶的mRNA表達(dá)差異；檢測移植后24 h，3 d，7 d，14 d，21 d各組大鼠血糖水平；移植后3周利用ELISA法檢測各組大鼠血漿胰島素分泌水平；蘇木精-伊紅染色觀察大鼠胰腺組織病理變化。結(jié)果與結(jié)論：熒光顯微鏡觀察到PEGFP-C3-BFGF轉(zhuǎn)染入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞48 h后，呈現(xiàn)出明顯的特異性綠色熒光；移植后2周與對照組比較，糖尿病組的基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達(dá)明顯增加(P 0.05)，移植組及基因轉(zhuǎn)染組基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA的表達(dá)較糖尿病組明顯下降(P 0.05)；移植后

6、不同時間點各組大鼠血糖比較，基因轉(zhuǎn)染組移植組對照組(均P 移植組糖尿病組，但基因轉(zhuǎn)染組仍對照組(均P 0.05)；各組大鼠胰腺組織病理情況比較，移植組優(yōu)于糖尿病組，基因轉(zhuǎn)染組又優(yōu)于移植組，接近于對照組。結(jié)果說明，PEGFP-C3-BFGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入糖尿病大鼠體內(nèi)，可以改善大鼠血糖水平，促進(jìn)胰島素的分泌，其可能是通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA的表達(dá)從而改善大鼠糖尿病病變程度。關(guān)鍵詞：干細(xì)胞；移植；糖尿?。籔EGFP-C3-BFGF；轉(zhuǎn)染；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；大鼠；療效 主題詞：干細(xì)胞；間質(zhì)干細(xì)胞；移植；糖尿??；成纖維細(xì)胞生長因子2；組織工程Effect of basic fibro

7、blast growth factor gene transfection on bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for diabetes mellitusTian Xue-pin, Liu Hai-ying (Department of Endocrinology, Chengde Central Hospital, Chengde , Hebei Province, China)AbstractBACKGROUND: Existing studies have shown that bone marrow mesenchy

8、mal stem cells can significantly improve islet function in diabetic rats to decrease excessively high blood glucose level, which may be related to the enhancement of differentiation ability of autologou pancreatic stem cells.OBJECTIVE: To observe the therapeutic efficacy of basic fibroblast growth f

9、actor gene eukaryotic expression vector (PEGFP-C3-BFGF) transfection of bone marrow mesenchymal stem cells in diabetic rats.METHODS: Recombinant adenovirus (Ad.aFGF) mediated PEGFP-C3-BFGF was transfected into bone marrow mesenchymal stem cells, and PEGFP-C3-BFGF expression was observed using fluore

10、scence microscopy. Eighty Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group, diabetes group, transplantation group, gene transfection group, with 20 rats in each group. After modeling, rats in different groups were given portal vein injection of normal saline, PBS, 1 mL of bone mar

11、row mesenchymal stem cell suspension, and 1 mL of PEGFP-C3-BFGF-transfected bone marrow mesenchymal stem cell suspension. RT-PCR method was used to detect mRNA expression of matrix metalloproteinases in pancreatic tissue of rats in each group. Blood glucose levels of rats were detected at 24 hours,

12、3, 7, 14, 21 days after transplantation. ELISA method was used to detect plasma insulin levels in rats. Pathological changes of the pancreas were observed using hematoxylin-eosin staining.Tian Xue-pin, Master, Attending physician, Department of Endocrinology, Chengde Central Hospital, Chengde , Hebe

13、i Province, ChinaRESULTS AND CONCLUSION: Under the fluorescence microscope, PEGFP-C3-BFGF transfected into cells after 48 hours showed significant specific red fluorescence. Two weeks after transplantation, matrix metalloproteinases mRNA expression was significantly increased in the diabetes group c

14、ompared with the control group (P 0.05), while it was decreased in the transplantation and gene transfection groups compared with the diabetes group (P 0.05). After transplantation, the blood glucose levels in rats were ranked as follows: control group gene transfection group transplantation group d

15、iabetes group (P gene transfection group transplantation group diabetes group (P 0.05). Pathological findings of the pancreas showed that the transplantation group was superior to the diabetes group, but inferior to the gene transfection group that was similar to the control group. All these finding

16、s indicate that PEGFP-C3-BFGF-transfected bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can improve blood glucose levels and stimulate insulin secretion in diabetic rats, which may improve the severity of diabetes mellitus by decreasing the mRNA expression of matrix metalloproteinases.Subject he

17、adings: Stem Cells; Mesenchymal Stem Cells; Transplantation; Diabetes Mellitus; Fibroblast Growth Factor 2; Tissue EngineeringCite this article: Tian XP, Liu HY. Effect of basic fibroblast growth factor gene transfection on bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for diabetes mellitus. Zho

18、ngguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(36):5385-5391.0 引言 Introduction流行病學(xué)資料顯示，糖尿病的發(fā)病率不斷升高，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的生命健康1-3。一直以來口服藥物及胰島素被視為治療糖尿病的主要手段4。目前采用基因工程手段建立內(nèi)源性胰島素排泄得到了人們廣泛的關(guān)注5-6，但由于排異反應(yīng)和來源不足等問題，限制其廣泛應(yīng)用于臨床。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是成體干細(xì)胞的一種，可向不同方向分化7-8，在特定環(huán)境中，能夠分化為多種組織類型的非造血細(xì)胞9-14。加之具有易培養(yǎng)、增殖快、不涉及德行和倫理學(xué)爭端等優(yōu)點，為糖尿病的血糖控制及延緩疾病進(jìn)展提供

19、了有效手段，在未來的醫(yī)學(xué)發(fā)展中很可能成為首選手段15。堿性成纖維細(xì)胞生長因子具有極其廣泛的作用和至關(guān)重要的價值，能夠維持人胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)；還能夠調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移分化從而參與血糖的調(diào)節(jié)。許多體內(nèi)外實驗均表明外源性植入堿性成纖維細(xì)胞生長因子能明顯改善血糖狀態(tài)，但是植入于體內(nèi)的外源性堿性成纖維細(xì)胞生長因子易于降解，影響其療效16。隨著基因工程中分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)及廣泛應(yīng)用，可將堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)染至種子細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，使其能夠超表達(dá)堿性成纖維細(xì)胞生長因子蛋白以達(dá)到治療糖尿病的目的。但堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)染是否影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長特性而達(dá)到治療糖尿

20、病的目的?為此，文章將構(gòu)建的堿性成纖維細(xì)胞生長因子真核分泌表達(dá)載體PEGFP-C3-BFGF轉(zhuǎn)染至分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，觀察堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)染對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長特性的影響，以便進(jìn)一步研究堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對血糖的調(diào)控能力。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計 隨機(jī)對照動物實驗。1.2 時間及地點 實驗于2014年10月至2015年11月在河北省動物實驗室完成。1.3 材料實驗動物：80只雌雄不限的SD大鼠，體質(zhì)量150-200 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK(冀)2007-000

21、5。SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、糖尿病組、移植組及基因轉(zhuǎn)染組4組，每組各20只，單獨放于4個籠子里。保持動物良好的衛(wèi)生條件，允許其自由采食，并給與供水。其中：對照組給予門靜脈注射生理鹽水；糖尿病組門靜脈注射PBS；移植組門靜脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液1 mL；基因轉(zhuǎn)染組門靜脈注射等量轉(zhuǎn)染PEGFP-C3-BFGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液。實驗材料及來源：EGFP-C3-bFGF由醫(yī)學(xué)實驗科保存；限制性內(nèi)切酶EcoR、Hind 、T4 DNA連接酶(大連寶生物工程有限公司)，TaqDNA聚合酶(BioLabs，NEWENGLAND)，含有EGFP的真核表達(dá)載體(pEGFP- C3，Invitrog

22、en，USA)，質(zhì)粒提純試劑盒、DNA膠純化試劑盒(Promega，USA)，含bFGF cDNA的質(zhì)粒PBR322_bFGF(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院七所施明老師惠贈)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Cell Applications公司)，大腸桿菌Topi0感受態(tài)(本實驗室保存)，2 000 DNA Marker、1 kb DNA Marker(大連寶生物工程有限公司)?？股豍SA (Cascade公司)；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑及Trizol(Invitrogen公司)；蘇木精染液(解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍創(chuàng)傷修復(fù)重點實驗室)。1.4 方法 1.4.1 熒光染色標(biāo)記轉(zhuǎn)染PEG

23、FP-C3-BFGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染前5.0-6.0 h進(jìn)行新培養(yǎng)基的更換；將質(zhì)粒和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基均置于無菌EP管中，輕輕晃動，使其均勻；將脂質(zhì)體和培養(yǎng)基均置于EP管中，并進(jìn)行晃動，室溫溫育；將步驟、結(jié)束時得到的液體進(jìn)行混合，并在室溫下溫育；將上一步中得到的混合液加入到培養(yǎng)孔以及培養(yǎng)瓶中，晃動使其均勻；置于37 、體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h；棄去液體，按照0.5 mL/孔的標(biāo)準(zhǔn)在24孔板中加入耐骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基,按照1.5 mL/孔于6孔板中加入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，加入3 mL骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

24、培養(yǎng)基于25 cm2培養(yǎng)瓶中，將其放于培養(yǎng)箱中待用；36 h末，對各個的表達(dá)情況進(jìn)行測定。25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中PEGFP-C3-BFGF轉(zhuǎn)染至骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)36 h后,在488 nm波長處對熒光的產(chǎn)生情況進(jìn)行測定,并選取5個隨機(jī)視野，對其熒光陽性細(xì)胞數(shù)和該視野中總的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行觀察，計算按上述步驟操作后的轉(zhuǎn)染情況。1.4.2 采用鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射 禁食12 h后，于大鼠尾靜脈處取血測定血糖值，然后按照60 mg/kg劑量體內(nèi)注射鏈脲佐菌素，再次于同一部位取血，檢測糖尿病模型是否建造成功。若造模后空腹血糖值 6.7 mmol/L，且具有糖尿病三多一少的癥狀，即為糖尿病造模成

25、功17。STZ模型創(chuàng)立后于對照組經(jīng)靜脈途徑給予0.9%NaCl，糖尿病組經(jīng)靜脈途徑給予等量PBS，移植組經(jīng)靜脈途徑給予1 mL 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液(含1107個細(xì)胞)，PEGFP-C3-BFGF組經(jīng)靜脈途徑給予等量轉(zhuǎn)染PEGFP-C3-BFGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸液。1.4.3 RT-PCR檢測基質(zhì)金屬蛋白酶 mRNA表達(dá) 移植后2周，參照Trizol中提到的實驗步驟提取各組大鼠胰島組織RNA。將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再將得到的產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，其中cDNA合成及反應(yīng)的內(nèi)參照以-actin為準(zhǔn)。PCR所用的引物序列：基質(zhì)金屬蛋白酶上游引物為5-CTG AAG TGT CAC AGC CTG TT

26、T-3，下游引物為5-CAC ACA TGC GTG AAA CCT GTA-3；-actin：上游引物為 5-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3，下游引物為5-CTC AGC CTT GAC TGT GCC-3。PCR反應(yīng)條件：94 變性1 min，55 退火45 s，72 延伸1 min，循環(huán)32周后72 延伸7 min。每一步反應(yīng)均進(jìn)行重復(fù)操作3次。對得到的終產(chǎn)物進(jìn)行測定，計算mRNA表達(dá)量。1.4.4 檢測血糖水平、比較血糖改善情況 于移植后 24 h，3 d，7 d，14 d，21 d對各組大鼠的空腹血糖進(jìn)行監(jiān)測，并對各大鼠進(jìn)行OGTT試驗，觀察移植后不同時間點的反應(yīng)

27、性，從而比較血糖的改善情況。1.4.5 ELISA法檢測大鼠血漿胰島素分泌水平 移植治療第3周，用乙醚麻醉各組大鼠，經(jīng)大鼠主動脈取血，取部分血漿按胰島素ELISA試劑盒說明書的方法，測定各組大鼠血漿胰島素濃度。在試劑盒中提供的酶標(biāo)板上將單抗進(jìn)行包被，再根據(jù)操作步驟加入樣品及不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，加入二抗，在酶標(biāo)板上形成雙抗夾心的聚合物，加入用HRP標(biāo)記的Streptavidin，根據(jù)說明書中的操作步驟加入底物，使液體顯色，避光靜置，再加入終止液，觀察顯色加深，用酶標(biāo)儀進(jìn)行空腹胰島素水平的測量。根據(jù)公式胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖空腹胰島素水平/22.5進(jìn)行胰島素抵抗指數(shù)的計算。1.4.6 蘇木精-伊紅

28、染色法觀察胰腺組織病理變化 移植8周末，將糖尿病大鼠采用頸椎脫臼處死并迅速切開皮膚、皮下，進(jìn)入腹腔，觀察胰腺的一般狀況。取出各組大鼠的胰腺組織，去掉周圍的系膜及脂肪組織，縱行切開，PBS洗凈附著物，用體積分?jǐn)?shù)4%甲醛進(jìn)行固定，并行常規(guī)石蠟包埋及切片。將切片進(jìn)行脫蠟至水、蘇木精染色、系列鹽酸乙醇脫水、自來水反藍(lán)、伊紅染色、再次進(jìn)行乙醇脫水、透明及封固處理。觀察胰腺組織的病理變化。1.5 主要觀察指標(biāo) 觀察熒光染色標(biāo)記轉(zhuǎn)染PEGFP- C3-BFGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；RT-PCR法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶的mRNA表達(dá)；檢測血糖水平、比較血糖改善情況；ELISA法檢測大鼠血漿胰島素分泌水平；蘇木精-伊

29、紅染色法觀察胰腺組織病理變化。1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包對統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行分析。計量資料以s表示，各組間差異比較采用單因素方差分析，以P 0.05為差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results 2.1 實驗動物數(shù)量分析 實驗選用大鼠80只，分為4組，實驗過程無脫失，全部進(jìn)入結(jié)果分析。2.2 熒光顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞PEGFP-C3- BFGF的表達(dá)情況 PEGFP-C3-BFGF轉(zhuǎn)染入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡下可看到轉(zhuǎn)染了PEGFP-C3-BFGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，而未轉(zhuǎn)染PEGFP-C3-BFGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無綠色熒光表達(dá)，見圖1。

30、2.3 RT-PCR檢測基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達(dá) 移植后2周，對照組、糖尿病組、移植組及基因轉(zhuǎn)染組中均發(fā)現(xiàn)有基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達(dá)，與對照組比較，糖尿病組的基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達(dá)明顯增加，移植組及基因轉(zhuǎn)染組基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA的表達(dá)較糖尿病組明顯下降，各組間差異有顯著性意義(P 0.05)；見圖2。2.4 血糖觀察結(jié)果 移植后不同時間點糖尿病組的血糖水平明顯高于對照組，基因轉(zhuǎn)染組與移植組的血糖水平又顯著低于糖尿病組，差異有顯著性意義(P 0.05)，基因轉(zhuǎn)染組的血糖水平仍高于對照組，各組間比較差異均有顯著性意義(均P 0.05)，見表1。2.5 血漿胰島素分泌情況比較 基因轉(zhuǎn)染組的

31、空腹胰島素水平明顯高于移植組與糖尿病組，胰島素抵抗指數(shù)低于移植組與糖尿病組，組間比較差異均有顯著性意義(P 0.05)；基因轉(zhuǎn)染組的空腹胰島素水平仍低于對照組，胰島素抵抗指數(shù)高于對照組；各組空腹胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)比較差異均有顯著性意義(均P 0.05)；見表2。2.6 鏡下觀察蘇木精-伊紅染色后胰腺組織的病理變化 胰腺組織病理改善情況各組比較，移植組優(yōu)于糖尿病組，基因轉(zhuǎn)染組又優(yōu)于移植組，接近于對照組。對照組為正常胰腺組織，結(jié)構(gòu)清晰；糖尿病組的胰島結(jié)構(gòu)遭到破壞，胰島體積變小，數(shù)量變少，可看到纖維增生，以及炎性細(xì)胞的浸潤；移植組炎性細(xì)胞浸潤較糖尿病組減輕；基因轉(zhuǎn)染組炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，萎

32、縮變小的胰島逐漸增大，結(jié)構(gòu)恢復(fù)較為完整。見圖3。表1 各組大鼠不同時間點的血糖水平 (s，mmol/L)Table 1 Blood glucose levels of rats at different time after transplantation組別 24 h后 3 d后 7 d后 14 d后21 d后對照組 糖尿病組 移植組 基因轉(zhuǎn)染組 3.4110.459 11.2631.833 7.6540.974 5.5930.6263.3790.458 20.992.87816.2352.6736.0280.423 3.4170.457 22.0443.489 17.1702.0415.3

33、620.364 3.3880.460 22.9893.598 16.7352.256 5.9670.4213.4050.46022.9883.68217.9692.4575.2360.364表注：不同時間點各組間比較差異有顯著性意義(P 0.05)。表2 各組空腹胰島素水平與胰島素抵抗指數(shù)比較 (s)Table 2 Fasting insulin levels and insulin resistance index in rats圖1 熒光顯微鏡下觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞PEGFP-C3-BFGF的表達(dá)(100)Figure 1 PEGFP-C3-BFGF expression in bone

34、marrow mesenchymal stem cells under fluorescence microscope (100)圖注：圖A為未轉(zhuǎn)染PEGFP-C3-BFGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞僅見細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，胞漿無綠色陽性熒光信號；B為轉(zhuǎn)染了PEGFP-C3-BFGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光信號。BA組別 空腹胰島素水平 胰島素抵抗指數(shù)對照組 糖尿病組 移植組 基因轉(zhuǎn)染組 32.212.42 20.311.71 22.171.64 28.171.89 4.860.1120.730.1617.690.146.250.12表注：各組空腹胰島素水平比較及胰島素抵抗指數(shù)比較差異均有顯著性意

35、義(均P 0.05)。A B210a圖2 RT-PCR檢測各組大鼠的基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達(dá)Figure 2 RT-PCR detection of matrix metalloproteinases mRNA expression in rats圖注：圖A為各組基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA電泳表達(dá)；B顯示移植組及基因轉(zhuǎn)染組基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA的表達(dá)較糖尿病組明顯下降(aP 0.05)。對照組 糖尿病組 移植組 基因轉(zhuǎn)染組基質(zhì)金屬蛋白酶2 mRNA表達(dá)a基質(zhì)金屬蛋白酶2 -actin 對照組 糖尿病組 移植組 基因轉(zhuǎn)染組A B C D圖3 各組大鼠胰腺組織的病理變化(200)Figure 3 P

36、athological changes of the rat pancreas (200)圖注：圖A為正常胰腺組織，結(jié)構(gòu)清晰；B為糖尿病組胰島結(jié)構(gòu)遭到破壞；C為移植組炎性細(xì)胞浸潤較糖尿病組減輕；D為基因轉(zhuǎn)染組炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，萎縮變小的胰島逐漸增大，結(jié)構(gòu)恢復(fù)較為完整。3 討論 Discussion近年來，糖尿病的再生替代療法逐漸走入人們的視線，并引起人們的廣泛關(guān)注18-20。目前主要有胰腺移植、以及干細(xì)胞移植等方法來治療糖尿病21-23，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植成為醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注的焦點24-25。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有廣泛分化作用的細(xì)胞，在不同的條件下能夠分化為不同類型的細(xì)胞，在給予某

37、種特定條件后可向特定方向分化26-29。研究表明，通過外源性基因?qū)撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行修飾，進(jìn)而創(chuàng)建出一種“細(xì)胞載體”用于安全的基因治療；而且，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不存在移植排斥反應(yīng)及倫理學(xué)爭議，從而真正實現(xiàn)自體移植30-32。此外，已有研究證實骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以明顯提高糖尿病大鼠胰島功能恢復(fù)及改善高血糖狀態(tài)，這可能與自體胰腺干細(xì)胞分化能力增強(qiáng)有關(guān)33-36。迄今為止很多證據(jù)已表明，在一定的條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠向調(diào)節(jié)血糖的方向分化37。堿性成纖維細(xì)胞生長因子是在人體中存在的非常微量的活性物質(zhì)，具有廣泛分布及促進(jìn)特定細(xì)胞增殖的作用38。但是給予機(jī)體注射外源性堿性成纖維細(xì)胞生長因子后在體

38、內(nèi)易發(fā)生降解，影響其廣泛應(yīng)用。自堿性成纖維細(xì)胞生長因子的cDNA問世以來，其研究取得重大進(jìn)展。實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)從外源途徑給予堿性成纖維細(xì)胞生長因子時可以誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島細(xì)胞分化，參與機(jī)體糖代謝紊亂的調(diào)節(jié)，進(jìn)而對糖尿病起到一定的作用。因此，作者通過構(gòu)建PEGFP-C3-BFGF，使其在大鼠胰腺細(xì)胞表達(dá)，研究其對糖尿病的作用。實驗結(jié)果顯示：PEGFP-C3-BFGF轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后，4組大鼠均發(fā)現(xiàn)有基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達(dá)，且于對照組比較，糖尿病組的基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA表達(dá)明顯增加，移植組及基因轉(zhuǎn)染組基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA的表達(dá)較糖尿病組明顯下降；不同時間點胰島素分泌情況及血糖

39、水平得到不同程度改善，深一步研究發(fā)現(xiàn)PEGFP-C3-BFGF通過誘導(dǎo)胰腺組織新生血管形成，引起胰島細(xì)胞的再生，從而修復(fù)細(xì)胞功能，因此可推測PEGFP-C3-BFGF轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要起促進(jìn)作用，并且無移植后的免疫排斥反應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)移植后不同時間點，各組大鼠血糖改善情況基因轉(zhuǎn)染組移植組對照組，提示給你提輸入外源轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以很大程度上改善糖尿病的糖代謝紊亂狀態(tài)。研究結(jié)果顯示：PEGFP-C3-BFGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入糖尿病大鼠體內(nèi)，可以改善大鼠血糖水平，促進(jìn)胰島素的分泌，表明其移植后不僅能在體內(nèi)良好存活，而且可進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞再生，調(diào)節(jié)血糖。猜測其機(jī)制可能是通過將

40、基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA的表達(dá)降低從而起到改善大鼠糖尿病病變程度的作用?？傊?，將PEGFP-C3-BFGF轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入糖尿病大鼠體內(nèi)，不僅對血糖起到很好的調(diào)節(jié)作用，而且能避免易分解的的作用缺陷，必對糖尿病的的防治起到重要作用。作者貢獻(xiàn)：設(shè)計、實施、評估者分別為第一、二作者。是盲法評估。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問題：實驗動物在戊巴妥納麻醉下進(jìn)行所有的手術(shù)，并盡一切努力最大限度地減少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對研究

41、和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機(jī)數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻(xiàn) References1 袁鳳山,王長軍,董飛,等.誘導(dǎo)回輸胰島素分泌細(xì)胞對大鼠糖尿病的療效J.中國生物工程雜志, 2011,31(5):94- 98. 2 Zhang YQ,Li JT,Wang TJ,et al.Amplitude of sensory nerve action potential in early stage diabetic peripheral neuropa

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