生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)課：原位雜交

1、,原 位 雜 交,In situ hybridization,原 理,原位雜交技術(shù)原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)技術(shù) 是分子生物學(xué)和組織化學(xué)成功結(jié)合的產(chǎn)物。是以特定標(biāo)記的已知序列核酸作為探針，與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行原位檢測(cè)的方法（in situ hybridization）。 含互補(bǔ)序列的標(biāo)記DNA或RNA片段（即探針），在適宜的條件下與細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或RNA形成穩(wěn)定的雜交體，對(duì)雜交體進(jìn)行檢測(cè)。,由于原位雜交技術(shù)不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，更能準(zhǔn)確地反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)； 能在成分復(fù)雜的組

2、織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其它成分的影響，因此對(duì)于那些細(xì)胞數(shù)量少且散在于其他組織中的細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA研究更為方便 。,優(yōu) 點(diǎn),用標(biāo)記的探針與分裂中期染色體DNA雜交以研究染色質(zhì)中特定核酸序列在染色體中的精確定位； 與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交以觀察該組織細(xì)胞中特定基因表達(dá)水平； 用特異性的細(xì)菌、病毒的核酸作為探針對(duì)組織、細(xì)胞進(jìn)行雜交，以確定有無(wú)該病原體的感染等。,最早應(yīng)用于60年代末期，由于核酸分子雜交的特異性高,并可精確定位，因此該技術(shù)廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的研究中，如研究細(xì)胞的生物學(xué)功能、基因表達(dá)的規(guī)律、腫瘤發(fā)生機(jī)制及病原微生物的檢測(cè)。,應(yīng) 用,根據(jù)其檢測(cè)物而分為: 細(xì)胞內(nèi)原

3、位雜交 組織切片內(nèi)原位雜交 根據(jù)其所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同可分為: DNA-DNA雜交 RNA-DNA雜交 RNA-RNA雜交,分 類,探針：原位雜交中用于組織細(xì)胞內(nèi)特定的DNA或mRNA序列定位的關(guān)鍵試劑。 種類：DNA，雙鏈cDNA ，單鏈cDNA，合成寡合苷酸、 單鏈cRNA及 PCR產(chǎn)物。 長(zhǎng)度：50-300個(gè)堿基（bp）。小分子探針穿透力強(qiáng)，大分子探針可在組織細(xì)胞中形成網(wǎng)絡(luò)而增加雜交信號(hào)，同時(shí)也使本底增高。 雜交條件：雜交的特異性依賴于探針的結(jié)構(gòu)、雜交溫度（高溫嚴(yán)謹(jǐn)）、pH及雜交液中甲酰胺（高濃度）和鹽離子的濃度（低鹽）。,探 針 制 備,探針標(biāo)記：酶反應(yīng)法，化學(xué)反應(yīng)法 用顯色法

4、檢測(cè)： 雜交后樣品，與抗地高辛抗體結(jié)合， 檢測(cè)抗地高辛抗體帶有的堿性磷酸酯酶。,探針制備和檢測(cè),DIG，digoxigenin，類固醇半抗原， 通過(guò)一個(gè) 11個(gè)碳原子的連接臂與尿嘧啶環(huán)上第五組碳原子相連，形成DIG標(biāo)記的尿嘧啶核苷酸DIG-11-dUTP。,探 針 制 備,DIG DNA Labeling and Detection Kit (Roche),探針制備和檢測(cè),對(duì)蝦白斑綜合癥病毒 （White spot syndrome virus, WSSV ）,WSSV是養(yǎng)殖對(duì)蝦最主要病原。這種病毒引起的暴發(fā)性疾病于八十年代在臺(tái)灣流行，1993年流行于我國(guó)，而后在東南亞地區(qū)都相繼有報(bào)道。該病致

5、死率高，感染多種對(duì)蝦，危害性大，許多蝦池減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)，蝦產(chǎn)量急劇下跌，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，是目前威脅對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的重要因素。 WSSV 病毒粒子為卵形桿狀，外被囊膜，囊膜在尾部延伸成一長(zhǎng)尾。完整的病毒粒子大小為(110130)nm(260350)nm WSSV, 大的DNA病毒，基因組為環(huán)狀，大小為300多Kb， 在病毒分類上屬于Nimaviridae科， Whispovirus屬，WSSV為其代表種。 選取一段序列，標(biāo)記為探針，檢測(cè)對(duì)蝦感染W(wǎng)SSV狀況,1. 取材 2. 固定 3. 脫水和包埋（按常規(guī)組織切片技術(shù)操作） 4. 切片 5. 雜交 6. 沖洗與顯色 7. 終止顯色與復(fù)染 8 . 封片

6、 9. 觀察與拍照,實(shí)驗(yàn)方法和步驟,現(xiàn)場(chǎng)取瀕死的斑節(jié)對(duì)蝦或者其它對(duì)蝦，先在第2、3腹節(jié)間和頭胸部注射固定液全身固定，切取頭胸部，從額劍將頭胸部分成兩部分，固定液中固定1224h ，轉(zhuǎn)入70%酒精中保存。 組織塊(V) ：固定液(V)= 1 ：30 Davidsons AFA固定液，室溫固定一般不超過(guò)24h；4多聚甲醛4固定，不超過(guò)6h。將樣品轉(zhuǎn)入70酒精保存（保存時(shí)間不要過(guò)久，否則會(huì)影響DNA的保存質(zhì)量）。,固 定,70%乙醇 1h2 可停留 80%乙醇 1h2 可停留 95%乙醇 1h2 無(wú)水乙醇 45min2 1/2無(wú)水乙醇 + 1/2二甲苯 20 min 二甲苯 5 min2 1/2二甲

7、苯 + 1/2石蠟 30 min 60 烘箱 石蠟I 45min1h 60 烘箱 石蠟II 45min1h 60 烘箱 石蠟III 45min1h 60 烘箱 石蠟包埋,脫 水 和 包 埋,載玻片和蓋玻片的準(zhǔn)備： 3% HCl + 95%乙醇浸泡30min以上，擦干備用。 硅化載玻片： 2% APES于丙酮中 2min 丙酮 1min dH2O 1min 37 烘干備用 切46m厚，42展片。,切 片,烘片： 60 45min 脫蠟與水化： 二甲苯 10min2 1/2無(wú)水乙醇 + 1/2二甲苯 5min 無(wú)水乙醇 23min2 95%乙醇 23min2 80%乙醇 23min 70%乙醇 2

8、3min 可停留 dH2O 23min,脫蠟與水化,消化： 1TNE 5min Pr.K 200l/片(10g/ml ) 37 10 min（濕盒內(nèi)） (10mg/ml母液用1TNE稀釋1000倍) 后固定： 0.4%甲醛 5min 雜交： 2SSC 5min 探針先于100變性510 min，立即置冰上5min。 加入含1025ng/100l探針的雜交液100l/片， 并用蓋玻片和礦物油封片， 95， 6 min 立即置冰上 5min 42雜交 (濕盒內(nèi)) 過(guò)夜,雜 交,2SSC 37 5min2 1SSC 37 5min2 1Buffer I 室溫 5min Buffer II 200l/

9、片 37 （濕盒內(nèi)） 5min (Buffer II用Buffer I 配制，加熱溶解) Ap（抗DIG抗體） 100l/片 37（濕盒內(nèi)） 3045min (用BufferII 稀釋2000倍） 1Buffer I 室溫 5min2 Buffer III 室溫 5min NBT/BCIP 200l/片 室溫（濕盒內(nèi)） 2 h過(guò)夜 (避光勿動(dòng)) (200l溶于10ml Buffer III中),沖 洗 與 顯 色,Buffer IV (停止顯色) 室溫 10 15min dH2O 室溫 23min 封片: 封片劑水性封片劑（預(yù)熱50） 蓋玻片先燒一下 觀察及拍照,終 止 顯 色 與 封 片,P

10、r.K消化時(shí)間一定要嚴(yán)格控制，時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)掉片；時(shí)間太短，則消化不夠，影響探針進(jìn)入，可能造成假陰性結(jié)果。 雜交時(shí)將蓋玻片輕輕放在載玻片上，放好后，不可移動(dòng)，以免壓壞蓋玻片下面的樣品，影響觀察。,提 示,Davidsons AFA固定液: 330 ml 95乙醇 220 ml 福爾馬林（3739甲醛水溶液） 115 ml 冰醋酸 335 ml H2O 混勻后封口，室溫放置； DIG標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒（Roche公司）； TNE： 50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base 10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl 1 mmol/L EDTA 0.37 g E

11、DTA ddH2O 900 ml （定容至1L） 用HCl調(diào)pH至7.4，高壓滅菌，4保存； 0.4% 甲醛： 3739% 甲醛 5.4 ml ddH2O 495 ml； 蛋白酶K溶液(Pr.K，10 mg/ml)： 10 mg Pr.K 溶于1 ml TNE中（用時(shí)現(xiàn)配）,試 劑,20SSC：3 mol/L NaCl 175.32 g NaCl 0.3 mol/L檸檬酸鈉 88.23 g 檸檬酸鈉 ddH2O 900 ml （定容至1L） 調(diào)pH至7.0，高壓滅菌，4保存； 2SSC： 20SSC 100 ml ddH2O 900 ml 4保存； 20Denhardts溶液： 0.4 牛清血

12、蛋白 0.4 g牛清血蛋白 0.4 聚蔗糖 0.4 g聚蔗糖 0.4 聚乙烯吡咯烷酮 0.4 g聚乙烯吡咯烷酮 ddH2O 100 ml 0.45 m 濾膜過(guò)濾，4保存； 25硫酸葡聚糖： 25 g硫酸葡聚糖溶于80 ml ddH2O（定容至100 ml），-20保存；,試 劑,雜交液： 4SSC 50% 甲酰胺 1Denhardts 5% 硫酸葡聚糖 0.5 mg/ml鮭精DNA 4保存； Buffer I： 100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base 150 mmol/L NaCl 8.77 g NaCl 用HCl調(diào)pH至7.5，高壓滅菌，4保存； Buff

13、er II： 0.5% Blocking agent Blocking agent 0.5 g Buffer I 100 ml 低溫加熱溶解，4保存一星期,試 劑,1、 Bruce,L.D.,et al.1993.Application of gene probes to detect a penaeid shrimp baculovirus in fixed tissue using in situ hybridization.Disease of Aquatic Organisms 17:215-221. 2、 Mari,J.,et al.1993.Partial cloning of t

14、he genome of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,an unusual parvovirus pathogenic for penaeid shrimps;diagnosis of the disease using a specific probe.J.General Virology 74:2637-2643. 3、 Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual.Boehringer Mannheim Corporation, BiochemicalProducts, 9115 Hague Road,P.O.Box50414,Indianapolis, IN 46250,USA.pp.1-75. 4、 Poulos,B.T.,et al.1994.Use of non-radioactively labeled DNA probes for the detection of a