PRUE-LAMP檢測結(jié)核分枝桿菌在 中國區(qū)縣實驗室診斷性能評估

1、.PRUE-LAMP檢測結(jié)核分枝桿菌在中國區(qū)縣實驗室診斷性能評估Xichao Ou1., Qiang Li1., Hui Xia1., Yu Pang1, Shengfen Wang1, Bing Zhao1, Yuanyuan Song1,Yang Zhou1, Yang Zheng1, Zhijian Zhang5, Zhiying Zhang2, Junchen Li2, Haiyan Dong2, Jack Zhang2, KaiMan Kam3, Junying Chi4, Shitong Huan4, Daniel P. Chin4*, Yanlin Zhao1*摘要：背景：能夠在

2、早期有效的檢測結(jié)核分枝桿菌，尤其是涂布陰性的結(jié)核病，對全球肺結(jié)核防控至關(guān)重要。環(huán)介導等溫擴增法與快速DNA提取法（PURE-LAMP）相結(jié)合，可以高靈敏性、高特異性、快速檢測痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌。盡管如此，PURE-LAMP尚缺乏足夠的評估，尤其是在資源有限的基層實驗室。本研究中，通過對來自中國兩個縣級實驗室肺結(jié)核疑似患者進行檢測，評估了PURE-LAMP法在基層實驗室檢測結(jié)核分枝桿菌的性能。方法與結(jié)果：自2011年4月-2012年2月，收集來自中國兩個縣級結(jié)核病實驗室的肺結(jié)核疑似患者三種痰液標本（即時痰，晚間痰和晨痰）用于檢測。用標準L-J培養(yǎng)法做對照，結(jié)果顯示， PURE-LAMP法檢測

3、即時痰標本結(jié)核分枝桿菌的靈敏度達到70.67%。同時，PURE-LAMP法在基于涂片呈陽性培養(yǎng)陽性，涂片陰性培養(yǎng)陽性的標本中靈敏度分別為92.12%和53.81%。PURE-LAMP法檢測即時痰結(jié)核分枝桿菌中的特異性為98.32%?；谌N樣本檢測結(jié)核分枝桿菌，PURE-LAMP法的靈敏度和特異性分別為88.80%和96.86%。與固體培養(yǎng)法相比，PURE-ALMP法可顯著降低污染率。結(jié)論和意義：結(jié)果表明，在中國的基層結(jié)核病防治實驗室檢測結(jié)核分枝桿菌，PURE-LAMP法具有較高的靈敏度和特異性。其具有高效、快速和安全的優(yōu)點，值得在基層及偏遠地區(qū)廣泛推廣使用。結(jié)核病仍然是威脅全世界健康的重大疾

4、病，2012年，據(jù)統(tǒng)計新發(fā)結(jié)核病約860萬，死亡人數(shù)約130萬1?？焖贉蚀_的診斷對結(jié)核病有效治療和防控至關(guān)重要2-3。目前，全世界范圍內(nèi)結(jié)核病常用的診斷方法是涂片鏡檢，眾所周知該方法靈敏度低，特別是對感染HIV的低免疫力病人4-5。培養(yǎng)法是結(jié)核病診斷的金標準，靈敏度較涂片法高，但培養(yǎng)耗時長（2周-8周）。為了滿足結(jié)核病防治快速靈敏的要求，一系列核酸擴增方法不斷涌現(xiàn)6-8；然而，由于分子檢測需要復雜的操作流程和昂貴的儀器，設(shè)施簡陋、技能缺乏的廣大基層實驗室尚不能滿足這些條件來開展。LAMP法是一種嶄新的恒溫核酸擴增方法12，不需要昂貴的儀器設(shè)備。TB-LAMP是日本榮研公司基于LAMP技術(shù)開發(fā)的

5、結(jié)核菌檢測試劑盒。它具有的一系列特征為資源缺乏的基層實驗室提供了分子檢測平臺：快速（40mins），恒溫（只需加熱快），穩(wěn)定（對抑制劑和反應(yīng)條件具有一定的容忍性），檢測結(jié)果可以直接用肉眼觀察判定13-15。2007-2010年，榮研公司與FIND基金會合作，成功研發(fā)出新一代TB-LAMP檢測試劑盒，即PRUE-LAMP，該試劑盒包括一個簡單的DNA提取過程16。PRUE-LAMP具有更高的靈敏度和特異性，并重新設(shè)計優(yōu)化了反應(yīng)引物。DNA的提取和擴增過程都可以在一個封閉的反應(yīng)管中進行，這樣可以有效減少污染風險。PRUE-LAMP包括3個步驟：樣本準備（10-20min），擴增（40min），直接

6、通過肉眼觀察熒光檢測結(jié)果（0.5-1min）17。為了評估PURE-LAMP的臨床性能，我們選擇了中國河南省2個區(qū)縣級實驗室進行實驗。材料和方法實驗設(shè)計本實驗在中國河南省兩個顯微鏡檢實驗室（獲嘉縣和新鄉(xiāng)市）進行。收集2011年4月-2012年2月來自門診就診的連續(xù)納入的肺結(jié)核疑似患者（連續(xù)咳嗽咳痰2周，咳血，伴有血樣痰）痰液標本用于研究，每位患者采集3種痰液（即時痰、晚間痰、晨痰），每份痰樣量至少2mL（0.1mL用于涂片，1mL用于培養(yǎng)，0.06mL用于PURE-LAMP實驗）。每份痰液樣本同時進行直接涂片抗酸染色、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP實驗，中國國家結(jié)核病參比實驗室（NTRL）的實驗

7、員收集所有培養(yǎng)呈陽性菌并進行16S-23S rDNA ITS測序分析來鑒別菌種。以固體培養(yǎng)為參照來評估PURE-LAMP性能。本實驗之前，兩個鏡檢實驗室均未做過固體培養(yǎng)和PCR實驗，為了確保LAMP檢測和培養(yǎng)實驗質(zhì)量，所有實驗員都在NTRL經(jīng)過1周的培訓。為了確保固體培養(yǎng)質(zhì)量，新鄉(xiāng)和獲嘉的工作人員預先進行了9個月的TB培養(yǎng)實驗培訓。LAMP實驗也在當?shù)卦囼烖c進行了培訓。方法葁-尼染色鏡檢和羅氏培養(yǎng)：實驗員按照痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊18的要求做好實驗室涂片鏡檢的室內(nèi)和室間質(zhì)量控制。固體培養(yǎng)時，痰液處理和接種方法參照WHO標準19，37培養(yǎng)8周。PURE-LAMP：PURE-LAMP實

8、驗步驟參照17，各個實驗室的操作人員均經(jīng)過廠商培訓并通過每人3個流程的熟練測試，操作流程如下：采用榮研公司生產(chǎn)的痰液專用大孔吸液器吸取60uL痰液于含有提取液的加熱管中，混勻后90加熱5min。然后將加熱管和吸附試劑管組裝并充分混勻直至白色試劑完全溶解。然后組裝上滴注蓋，擠壓30uL樣本于反應(yīng)管中。蓋好反應(yīng)管蓋子與反應(yīng)試劑充分溶解后與67反應(yīng)40min。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管置于熒光檢測裝置中判定并記錄結(jié)果。菌種鑒定：所有培養(yǎng)呈陽性菌經(jīng)過16S-23S rDNA ITS測序分析進行種屬鑒定。統(tǒng)計學分析采用TB-LAMP實驗特異性，靈敏性，陽性預測值（PPV），陰性預測值（NPV）來評估LAMP實驗

9、性能。以培養(yǎng)法為標準，所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件分析，P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果樣本來源自2011年4月-2012年2月共收集了初診可疑肺結(jié)核患者1378例，排除不合格的樣本，最終有1329例用于數(shù)據(jù)分析（圖1）。其中，888例是男性，441例是女性，53例年齡不到20歲，165 (12.42%)例涂片和培養(yǎng)呈陽性，210 (15.80%)例涂片呈陰性培養(yǎng)呈陽性，954(71.78%)培養(yǎng)呈陰性（表1）。 PURE-LAMP檢測即時痰性能在1329例疑似患者中，PURE-LAMP檢測結(jié)核菌的靈敏度和特異性（表2，圖1）。以固體培養(yǎng)法為參考標準，1203份（90.52%）與

10、固體培養(yǎng)法一致，靈敏度為70.67%，對與涂片呈陽培養(yǎng)呈陽的樣本，PURE-LAMP的靈敏度是92.12%，對于涂片呈陰培養(yǎng)呈陽的樣本，PURE-LAMP的靈敏度是53.81%，PURE-LAMP的特異性是98.32%。PURE-LAMP檢測不同時期痰標本以及不同時期混合標本性能分析了不同時期取得的痰液樣本（即時痰，夜間痰，晨痰）以及不同時期痰標本混合（即時痰+夜間痰，即時痰+晨痰，夜間痰+晨痰，即時痰+夜間痰+晨痰）的靈敏度和特異性（表3），結(jié)果表明三個時期混合標本的特異性和靈敏度要高于單個時期取的痰液樣本。PURE-LAMP和培養(yǎng)法污染率用PURE-LAMP 檢測475例新結(jié)核病疑似病人，

11、只有一份樣本污染，總污染率是0.21%。4129份樣本取自2個治療室的1378例患者，每份樣本分別接種2管培養(yǎng)，共培養(yǎng)8268份，其中276份污染，總污染率是3.3%。不同方法差異分析在培養(yǎng)呈陰性樣本中有30份樣本PURE-LAMP檢測呈陽，2份涂片呈陽。在PURE-LAMP檢測呈陰性樣本中，有42份培養(yǎng)呈陽性，其中，6份測序結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌，36份測序顯示為結(jié)核分枝桿菌，涂片呈陰性。26 (72.22%)份培養(yǎng)菌落數(shù)20。討論結(jié)核病的早期診斷對結(jié)核病的防治至關(guān)重要，隨著分子生物學的發(fā)展，一系列快速檢測和診斷TB的方法不斷涌現(xiàn)。LAMP技術(shù)是Notomi博士在2000年開發(fā)出的一種全新的核

12、酸擴增技術(shù)12。PURE-LAMP是一種新穎，簡便，防污染的TB檢測試劑盒。本研究中，PURE-LAMP對涂片呈陰培養(yǎng)呈陽的樣本靈敏度是53.81%，整體靈敏度為70.67%，特異性為98.32%，與其他研究結(jié)果一致11。與涂片鏡檢相比，靈敏度要高，結(jié)果表明PURE-LAMP可以用于檢測結(jié)核分枝桿菌。中國相關(guān)規(guī)定推薦采集結(jié)核病疑似患者3個時期樣本用于TB檢測21，本實驗中，我們評估了每種樣本對于結(jié)核病診斷的影響，PURE-LAMP實驗結(jié)果表明采集3個時期的痰液樣本用于檢測要比只采集即時痰意義更大。考慮到成本因素，避免給患者造成經(jīng)濟負擔，今后有必要評估PURE-LAMP法檢測不同時期樣本組合成本

13、。本實驗中PURE-LAMP的污染率是0.21%，2個試驗點操作都進行了嚴格分區(qū)，包括試劑存儲區(qū)，前處理區(qū)，擴增檢測區(qū)。每個區(qū)都標明清楚防止來回取試劑或者設(shè)備時混淆。實驗臺等都經(jīng)過5%的次氯酸鈉溶液消毒，實驗后經(jīng)過UV照射處理。通過嚴格控制和封閉實驗，極大的降低了污染率。PURE-LAMP結(jié)果報告時間比固體培養(yǎng)快。2h以內(nèi)即可根據(jù)肉眼觀察熒光判定結(jié)果。判斷時未發(fā)現(xiàn)模糊案例。20%的樣本經(jīng)過復檢后重復率100%。總的來說，PURE-LAMP是一種全新的診斷技術(shù)，可以快速、準確地檢測結(jié)核病患者，該實驗只需60ul痰液樣本，非常適合檢測肺結(jié)核病人，尤其是痰液較少患者，本研究表明PURE-LAMP可以

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