改 分子生物學(xué)實驗-實驗操作1.ppt

1、重組人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的構(gòu)建,分子生物學(xué)實驗-實驗操作,基因、載體、受體菌株,基因,載體,菌株,質(zhì)粒,酶切連接,轉(zhuǎn)化,質(zhì)粒提取,PCR,實驗技術(shù)要求,應(yīng)掌握的實驗技術(shù) 酶切,連接 凝膠回收 制備感受態(tài)細(xì)胞 質(zhì)粒提取 PCR 瓊脂糖凝膠電泳,考察指標(biāo) 電泳、藍(lán)白斑數(shù)量 電泳 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 電泳 電泳 電泳,實驗流程: 第一天 8AM-5PM,rhIL-18基因的PCR產(chǎn)物,質(zhì)粒pUC18,Bgl和Pst雙酶切,BamH和Pst雙酶切,濃度1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠回收與溶液回收,電泳檢驗,T4連接酶連接過夜,配制 LB 液體與固體平板培養(yǎng)基,滅菌,37過夜培養(yǎng) E .c

2、oli JM109菌株,實驗流程: 第二天 8AM-5PM,CaCl2 法制備E.Coli JM109感受態(tài)細(xì)胞,實驗組連接體系,42熱激轉(zhuǎn)化90s,37溫柔孵育45min,涂布平板,37過夜倒置培養(yǎng),實驗流程: 第三天 1PM-5PM,觀察陰性對照組菌落生長情況,有無菌落,挑取1白色單菌落,37液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),觀察實驗組菌落生長情況,統(tǒng)計藍(lán)斑，白斑菌落數(shù)量,觀察空菌對照組菌落生長情況,統(tǒng)計菌落數(shù)量,實驗流程: 第四天 8AM-5PM,提取質(zhì)粒DNA,濃度1%瓊脂糖凝膠電泳,PCR,濃度1%瓊脂糖凝膠電泳,雙酶切反應(yīng)（20L體系）,rhIL-18的PCR產(chǎn)物 目的基因 6.8L 無菌水 9

3、L BSA 0.2L Bgl 2L Pst 2L,質(zhì)粒pUC18 質(zhì)粒 10L 無菌水 6L BamH 2L Pst 2L,37酶切反應(yīng)3小時。,Hybrid site,培養(yǎng)基配制,LB液體培養(yǎng)基 每1L配量： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化鈉 5g 滴加0.2mL 5mol/L NaOH ，調(diào)節(jié)pH值至7.0 LB固體培養(yǎng)基: 每100ml液體培養(yǎng)基添加1.5g瓊脂 每組準(zhǔn)備： 3個30ml 液體培養(yǎng)基 120ml 固體培養(yǎng)基,滅菌,5個培養(yǎng)皿 3個30ml LB 液體培養(yǎng)基 1個120ml LB 固體培養(yǎng)基 一個50ml 離心筒 微量移液器槍頭,瓊脂糖電泳,瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定

4、和純化DNA 片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。 DNA 的分子大小 瓊脂糖濃度 DNA 分子的構(gòu)象 電源電壓 嵌入染料的存在 離子強度影響 瓊脂糖凝膠制作圖示,瓊脂糖凝膠的配制,稱取0.3g瓊脂糖，加入30ml 1TAE緩沖液，于微波爐中加熱沸騰3次。 取出稍冷后加入3L基因染料，混勻。 將凝膠倒入調(diào)平的凝膠板上，插入梳子。 冷卻。,瓊脂糖凝膠回收,瓊脂糖凝膠電泳檢驗，回收酶切產(chǎn)物：使用UNIQ-10柱式凝膠回收試劑盒 分別對： 目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收 載體片段（2.7Kb片段）進(jìn)行凝膠回收,1.柱平衡步驟：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500L平衡液BL，12000rpm離心1m

5、in，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 2.將單一的質(zhì)粒條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分）放入干凈的離心管中，稱取重量。 3.向膠塊中加入3倍體積膠液PN（如凝膠重為0.1g，其體積可視為100L，依此類推）。50水浴放置10min，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。如果還有未溶的膠塊，可再補加一些溶膠液或繼續(xù)放置幾分鐘，直至膠塊溶解（若膠塊的體積過大，可事先將膠塊切成碎塊）。（將目的基因體積補至50L，由此步平行操作。） 注意：膠塊完全溶解后最好將膠溶液溫度降至室溫再上柱，因為吸附柱在較高溫度時結(jié)合DNA的能力較弱。,瓊脂糖凝膠回收,4.將上一步所得溶液

6、加入一個吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2min，12000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。 注意：吸附柱容積為800L，若樣品體積大于800L可分批加入。 5.向吸附柱CA2中加入700L漂洗液PW，12000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中。 6.向吸附柱CA2中加入500L漂洗液PW，12000rpm離心30-60s，倒掉廢液。,7.將吸附柱CA2放回收集管中，12000rpm離心2min，盡量除盡漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。 注意：漂

7、洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗。 8.將吸附柱CA2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加10L洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min收集DNA溶液。再向吸附膜中間位置懸空滴加10L洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min收集DNA溶液。 注意:離心管中的EB緩沖液不要倒掉,DNA溶液即為EB緩沖液,平板鋪制,取出滅菌后的固體培養(yǎng)基 先鋪制1個平板(不含Amp)留作空菌對照。 每100ml瓶培養(yǎng)基中加入： IPTG 100ul X-Gal 200ul Amp 100ul 再鋪制4個平板,連接反應(yīng), 在滅菌的0.2m

8、L離心管（PCR管）中進(jìn)行 15L體積反應(yīng)體系中： 10快速連接緩沖液 1.5L rhIL-18雙酶切產(chǎn)物 X L 質(zhì)粒pUC18雙酶切產(chǎn)物 Y L T4-DNA連接酶 0.7L 加水補足15L 20連接1h,4連接1h,酶切產(chǎn)物比例換算,連接反應(yīng)中 目的基因：質(zhì)粒=3：1 連接反應(yīng)體系中加入目的基因和質(zhì)粒酶切片斷的體積比,=,感受態(tài)菌的制備,（1）E.coli JM109菌株37過夜培養(yǎng)以復(fù)蘇菌種，取過夜培養(yǎng)的菌液0.5mL加入到30 mL LB培養(yǎng)基中，37，230 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，至OD600約為0.4左右。 （2）無菌條件下，將30mL菌液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，冰上放置10

9、 min，使培養(yǎng)物冷卻至0。 （3）在預(yù)冷4的離心機上以4000r/min離心10min，棄去上清，加入10mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液重懸沉淀，冰浴上放置10 min。 （4）以4000r/min在4離心10min，棄去上清，每30mL初始培養(yǎng)物用1.0mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸細(xì)胞沉淀，200L/管分裝。,pUC18-hIL-18重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,（1）向分裝有200LE.coli JM109菌株感受態(tài)細(xì)胞的EP管中加入10L的上步中得到的連接混合物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，冰浴上放置30 min 實驗組 10L連接混合物 陽性對照 2L pUC18（濃度0.0

10、5g/L） 陰性對照 10L 無菌水 空菌對照 10L 無菌水,（2）將該EP管放入預(yù)加溫至42的水浴中，放置90s，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻12 min。 （3）向EP管加入800 L LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至37搖床上，150r/min，溫育45 min以復(fù)蘇菌株。,（4）涂布前將相應(yīng)培養(yǎng)物進(jìn)行稀釋。每兩組共用2個空菌對照，分別稀釋10-5 、10-6 ，將上述培養(yǎng)物各200L分別加到不含有氨芐的LB平板上；每組各做2個陽性對照，分別稀釋10-2 、10-3，將上述培養(yǎng)物各200L分別加到含有氨芐的LB平板上；每組陰性對照不需稀釋，直接將200L上述培養(yǎng)物加到含有氨芐的LB平板上；每組實驗組

11、培養(yǎng)物取原液，將上述培養(yǎng)物各200L分別加到含有氨芐的LB平板上。用涂布器將以上轉(zhuǎn)化細(xì)胞分別地輕輕涂布于瓊脂平板表面。 （5）將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平皿，37過夜培養(yǎng)。,感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的計算,轉(zhuǎn)化子總數(shù)陽性對照菌落數(shù)稀釋倍數(shù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積涂板菌液體積 轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)每mg質(zhì)粒DNA）轉(zhuǎn)化子總數(shù)質(zhì)粒DNA加入量(mg) 感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)空菌對照菌落數(shù)稀釋倍數(shù)菌液總體積涂板菌液體積 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率轉(zhuǎn)化子總數(shù)感受態(tài)細(xì)胞總數(shù),UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提,1柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500l的平衡液BL，12,000rpm離心1min，倒掉收

12、集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 2.取1.4ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入EP管中，12,000rpm離心1min，盡量吸除上清。 3.向留有菌體沉淀的離心管中加入250l溶液P1，使用移液器或漩渦振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。 注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。 4.向離心管中加入250l溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。 注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片段。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變清亮，可能由于菌體過多，裂解不夠徹底，應(yīng)減少菌體量。,5.向離

13、心管中加入350l溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm離心10min，此時在離心管底部形成沉淀。 注意：P3加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。 6.將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中），盡量不要吸出沉淀。12,000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。 7.向吸附柱CP3中加入600l漂洗液PW，12,000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。 8.向吸附柱CP3中加入600l漂洗液PW

14、，12,000rpm離心30-60s，倒掉收集管中的廢液。,9.將吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm離心2min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除。 注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗。建議將吸附柱CP3開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。 10.將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加75l洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12,000rpm離心1min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。,PCR鑒定陽性克隆原理,PCR鑒定,1、調(diào)整模板（ 待鑒定質(zhì)粒）濃度至 5 ng/ L 2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻， Template DNA 1.0 L 10 PCR buffer 2.0 L MgCl2（25mmol/L） 1.5 L M13 Primer M4 (10mol/L) 0.5 L M13 Primer RV(10mol/L) 0.5 L dNTPs （2mmol/L） 2.0 L Taq酶 （5U/L） 0.5L 加ddH2O至 20L,外源基因的特異引物： 引物M13 Primer M4:（5-GTTTTCCCAGTCAC