《食品微生物學(xué)》實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書

1、 食品微生物學(xué) 課程課程編號(hào)：實(shí) 驗(yàn) 指 導(dǎo) 書 主撰人 曾 智 審核人 陳躍進(jìn)單位：生命科學(xué)系 二O一二 年 六 月目 錄前言1實(shí)驗(yàn)一、顯微鏡油浸系物鏡的使用與微生物形態(tài)觀察3實(shí)驗(yàn)二、細(xì)菌的革蘭氏染色6實(shí)驗(yàn)三、微生物細(xì)胞大小測(cè)定和濃度測(cè)定8實(shí)驗(yàn)四、培養(yǎng)基的制備與滅菌12實(shí)驗(yàn)五、環(huán)境中微生物的檢測(cè)17實(shí)驗(yàn)六、水中細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)20前 言1 實(shí)驗(yàn)總體目標(biāo) 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是一門操作技能較強(qiáng)的課程。通過本課程的學(xué)習(xí)，要求學(xué)生牢固地建立無菌概念，掌握微生物實(shí)驗(yàn)的一套基本操作技術(shù)；樹立嚴(yán)謹(jǐn)、求實(shí)的科學(xué)態(tài)度，提高觀察、分析問題和解決問題的能力；樹立勤儉節(jié)約、愛護(hù)公物、相互協(xié)作的優(yōu)良作風(fēng)。 適用專業(yè)年級(jí) 生物

2、技術(shù)專業(yè)二年級(jí)第一學(xué)期 實(shí)驗(yàn)課時(shí)分配 24實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)要求實(shí)驗(yàn)類型每組人數(shù)實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡油浸系物鏡的使用與微生 物形態(tài)觀察必驗(yàn)證24實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革蘭氏染色必驗(yàn)證24實(shí)驗(yàn)三 微生物細(xì)胞大小測(cè)定和濃度測(cè)定必綜合24實(shí)驗(yàn)四 培養(yǎng)基的制備與滅菌必綜合24實(shí)驗(yàn)五 環(huán)境中微生物的檢測(cè)必驗(yàn)證24實(shí)驗(yàn)六 水中細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)必綜合244. 實(shí)驗(yàn)環(huán)境 在微生物學(xué)及發(fā)酵工程分室中進(jìn)行，要求至少提供8套可用的儀器設(shè)備，分析天平1臺(tái)，離心機(jī)1臺(tái)，分光光度計(jì)1臺(tái)，恒溫水浴3臺(tái)，高壓蒸汽滅菌鍋2臺(tái)，超凈工作臺(tái)3臺(tái)，恒溫?fù)u床2臺(tái)，恒溫培養(yǎng)箱2臺(tái)，干燥箱1臺(tái)，冰箱1臺(tái)。實(shí)驗(yàn)室面積60 M2以上，通風(fēng)、照明設(shè)施良好，消防

3、設(shè)備齊全，疏散通道正常。5. 實(shí)驗(yàn)總體要求通過本實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)，學(xué)生能基本上達(dá)到獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，通過老師的指導(dǎo)可完成研究性實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，能將微生物菌種分離與鑒定、無菌操作等相關(guān)知識(shí)應(yīng)用到課程設(shè)計(jì)、創(chuàng)新性研究、畢業(yè)論文等實(shí)踐性環(huán)節(jié)中。6. 本課程的重點(diǎn)、難點(diǎn)及教學(xué)方法建議（1）重點(diǎn)：無菌操作、微生物分離與鑒定等。（2）難點(diǎn)：嚴(yán)格按照微生物實(shí)驗(yàn)操作要求進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，并理解各注意事項(xiàng)的原因。（3）教學(xué)方法建議：注意理論與實(shí)際相結(jié)合，重視動(dòng)手能力的培養(yǎng)和鍛煉，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性進(jìn)行對(duì)照分析和檢測(cè)分析。對(duì)理論性較強(qiáng)、較為抽象的問題、原理著重講解，如革蘭氏染色法的原理和應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)一 顯微鏡油浸系物鏡的使用與

4、微生物形態(tài)觀察1、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用方法，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸系物鏡的使用方法。2、 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備及材料 微生物標(biāo)本裝片，香柏油，二甲苯，光學(xué)顯微鏡，擦鏡紙。3、 實(shí)驗(yàn)原理、方法和手段油鏡，即油浸接物鏡。當(dāng)光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時(shí)，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質(zhì)是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進(jìn)光量，從而使物象更加清晰。當(dāng)鏡與裝片之間的介質(zhì)為空氣時(shí)，由于空氣（n= 1.52）的折射率不同，光線會(huì)發(fā)生折射，不僅使進(jìn)入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會(huì)減

5、少鏡口角。當(dāng)以香柏油（n=1.515）為介質(zhì)時(shí)，由于它的折射率與玻璃相近，光線經(jīng)過載玻片后可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射，不僅增加了視野的照明度，更重要的是通過增加數(shù)值孔徑達(dá)到提高分辨率的目的。可見光的波長平均為0.55m。當(dāng)使用數(shù)值孔徑為0.65的高倍鏡時(shí)，它能辨別兩點(diǎn)之間的距離為0.42m；而使用數(shù)值孔徑為1.25的油鏡時(shí)，能辨別兩點(diǎn)之間的距離則為0.22m。光學(xué)顯微鏡的成像原理（倒立的虛像） 介質(zhì)為空氣與介質(zhì)為香柏油時(shí)光線通過的比較 4、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟（一）觀察前的準(zhǔn)備1、將顯微鏡置于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊沿約4cm。坐正后用左眼觀察。2、調(diào)節(jié)光源：將低倍物鏡轉(zhuǎn)到工作位置

6、，把光圈完全打開，聚光器升至與載物臺(tái)相距約1mm左右。轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡采集光源，光線較強(qiáng)的天然光源宜用平面鏡，光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，對(duì)光至視野內(nèi)均勻明亮為止。觀察染色裝片時(shí)，光線宜強(qiáng)；觀察末染色裝片時(shí)，光線不宜太強(qiáng)。（二）低倍鏡觀察染色裝片 首先上升鏡簡，將枯草芽孢桿菌染色裝片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，物鏡降至距裝片0.5cm處，適當(dāng)縮小光圈然后兩眼從目鏡觀察，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升(或使鏡臺(tái)下降)至發(fā)現(xiàn)物像時(shí)，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚為止。移動(dòng)裝片，把合適的觀察部位移至視野中心。（三）高倍鏡觀察 眼睛離開目鏡從側(cè)面觀察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正

7、下方，注意避免鏡頭與玻片相懂。再由目鏡觀察，仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距使物鏡清晰為止。將最適宜觀察部位移至視野中心，繪圖。不要移動(dòng)裝片位置，準(zhǔn)備用油鏡觀察。（四）油鏡觀察1、提起鏡筒約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位（鏡頭的正下方）滴一滴香柏油。2、從側(cè)面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴(kuò)大為止，鏡頭幾乎與裝片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。3、將光線調(diào)亮，左眼從目鏡觀察，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升（切忌反方向旋轉(zhuǎn)），當(dāng)視野中有物像出現(xiàn)時(shí)，再用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如因鏡頭下降未到位或鏡頭上升太快末找到物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡

8、降下，重復(fù)操作直至物像看清為止。仔細(xì)觀察并繪圖。4、再次觀察 提起鏡筒，換上金黃色葡萄球菌染色裝片，依次用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察，繪圖。重復(fù)觀察時(shí)可比第一次少加香柏油。（五）鏡檢完畢后的工作1、移開物鏡鏡頭。2、取出裝片。3、清潔油鏡，油鏡使用完畢后，須用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯擦掉殘留的香柏油，最后再用干凈的擦鏡紙擦干殘留的二甲苯。4、擦凈顯微鏡，將各部分還原。將接物鏡呈“八”字形降下，不可使其正對(duì)聚光器，同時(shí)降下聚光器，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡使其鏡面垂直于鏡座。最后套上鏡罩，對(duì)號(hào)放入鏡箱中，置陰涼干燥處存放。5、 思考題1、 使用油鏡應(yīng)特別注意哪些問題？為什么必須用香柏油？2

9、、 使用顯微鏡繪圖時(shí)，眼睛的位置應(yīng)該如何？3、 鏡檢標(biāo)本時(shí)，為什么先用低倍鏡觀察，而不是直接用高倍鏡或油鏡觀察？4、轉(zhuǎn)到高倍鏡和油鏡時(shí)，對(duì)照明度有何要求？應(yīng)如何調(diào)節(jié)？6、 注意事項(xiàng)及其它說明1、 不準(zhǔn)擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2、 拿顯微鏡時(shí)，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。3、 下降鏡頭時(shí)，一定要從側(cè)面注視，切忌用眼睛對(duì)著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭的錯(cuò)誤操作，以免壓碎玻片而損壞鏡頭。4、 觀察標(biāo)本時(shí)，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。特別在使用油鏡時(shí)，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。使用油鏡后，及時(shí)用二甲苯清潔油鏡和載玻片。注意二甲苯不能過多，以

10、防溶解固定透鏡的樹脂。5、 注意保持顯微鏡的潔凈，對(duì)金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。6、 顯微鏡應(yīng)存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的革蘭氏染色 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握細(xì)菌的革蘭氏染色，了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。二、實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備及材料 菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）大腸桿菌（E.coli） 試劑：草酸銨結(jié)晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番紅液 其他：顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、無菌水、香柏油、二甲苯等。三、實(shí)驗(yàn)原理、方法和手段 革染氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要

11、的鑒別染色法。革染氏染色的機(jī)理，與細(xì)菌細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)有關(guān)。經(jīng)結(jié)晶紫初染以后，所用的細(xì)菌都被染成藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合形成復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用乙醇脫色時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的，革染氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成、壁厚、類脂含量低，用乙醇脫色處理時(shí)細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)；革染氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁中肽聚糖層在內(nèi)層且較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類脂被乙醇溶解、細(xì)胞壁透性增加，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物被洗脫出來。用蕃紅復(fù)染時(shí)染上紅色。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟1、

12、細(xì)菌的活化：將細(xì)菌接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)約24h。2、制片：取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。3、初染：于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。4、媒染：用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。5、脫色：用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇從載玻片上端沖洗脫色，直到流下的酒精無明顯的紫色時(shí)，立即水洗。酒精的濃度、用量及涂片厚度都會(huì)影響脫色速度。脫色是革蘭氏染色中最關(guān)鍵的一步。6、復(fù)染：滴加番紅液，染色2min，水洗。7、用濾紙吸干，油鏡鏡檢。五、思考題 影響革蘭氏染色結(jié)果的最關(guān)鍵的因素是什么？六、注意事項(xiàng)及其它說明為了保證革染氏染色結(jié)果的正

13、確性，制片過程中要注意：要選用活躍生長的幼培養(yǎng)物作革染氏染色，涂片不宜過厚，火焰固定不宜過熱，脫色時(shí)間的控制。另外，可選用標(biāo)準(zhǔn)的革染氏陽性菌和革染氏陰性菌和未知菌一起混合涂片和染色。實(shí)驗(yàn)三 微生物細(xì)胞大小測(cè)定和濃度測(cè)定 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解測(cè)量微生物大小的原理；學(xué)習(xí)并掌握接目鏡測(cè)微尺的校正方法及微生物大小的測(cè)定方法，增強(qiáng)微生物細(xì)胞大小的感性認(rèn)識(shí)。 學(xué)習(xí)并掌握血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的原理；掌握利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。2、 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備及材料 菌種：啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌懸液。 儀器或其他用具：顯微鏡，目鏡測(cè)微尺，鏡臺(tái)測(cè)微尺，載玻片，蓋玻片。 其它：顯微鏡

14、、血球計(jì)數(shù)板、手動(dòng)計(jì)數(shù)器、擦鏡紙、吸水紙等。三、實(shí)驗(yàn)原理、方法和手段 微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物細(xì)胞個(gè)體較小，需要在顯微鏡下借助于特殊的測(cè)量工具測(cè)微尺來測(cè)定其大小。測(cè)微尺包括鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺。鏡臺(tái)測(cè)微尺是一張中央部分刻有精確等分線的載玻片，專門用于校定接目鏡測(cè)微尺每小格的相對(duì)長度。通常，刻度的總長是1mm，被等分為100格，每格0.01mm（即10m）。鏡臺(tái)測(cè)微尺不直接用來測(cè)量細(xì)胞的大小。目鏡測(cè)微尺是一塊可以放入接目鏡的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，有等分為50小格和100小格的兩種。在測(cè)量時(shí)將目鏡測(cè)微尺放在目鏡的隔板上，即可來測(cè)量經(jīng)顯微

15、鏡放大后的細(xì)胞物象。也有專用的目鏡，里面已經(jīng)安放好了目鏡測(cè)微尺。由于目鏡測(cè)微尺所測(cè)量的是經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象，因此，在不同的顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測(cè)微尺每一小格所代表的實(shí)際長度也不一樣。所以，在用目鏡測(cè)微尺測(cè)量微生物大小之前，必須先用鏡臺(tái)測(cè)微尺校定目鏡測(cè)微尺，以確定該顯微鏡在特定放大倍數(shù)的目鏡和物鏡下，目鏡測(cè)微尺每一小格所代表的實(shí)際長度，然后根據(jù)微生物細(xì)胞相當(dāng)于的目鏡測(cè)微尺格數(shù)，計(jì)算出微生物細(xì)胞的實(shí)際大小。 利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該方法是將菌懸液放在血球計(jì)數(shù)板與蓋玻片之間容積一定的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，然后根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果

16、計(jì)算單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由4條槽構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為9個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的邊長為1mm，中間平臺(tái)下陷0.1mm，故蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3。常見血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室有兩種規(guī)格：一種是1625型，即計(jì)數(shù)室共分為16個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分為25個(gè)小方格；另一種是2516型，即計(jì)數(shù)室先被分成25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分為16個(gè)小方格。但無論是哪一種規(guī)格的血球計(jì)數(shù)板，其計(jì)數(shù)室的小方格都是400個(gè)。我們采用的是2516型。計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)5個(gè)中方格的總菌

17、數(shù)，再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。計(jì)算公式：1ml菌液中總菌數(shù)5104 AB（A為5個(gè)中方格中的總菌數(shù)，B為稀釋倍數(shù)）4、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟（一）微生物細(xì)胞大小測(cè)定1、裝目鏡測(cè)微尺：取下顯微鏡的目鏡，換上專用目鏡。如果沒有專用的目鏡，則取下顯微鏡的目鏡，旋下透鏡，將目鏡測(cè)微尺刻度朝下放在目鏡的隔板上，再旋上目鏡透鏡，將裝有測(cè)微尺的目鏡裝回鏡筒。2、目鏡測(cè)微尺的標(biāo)定： （1）放鏡臺(tái)測(cè)微尺：將鏡臺(tái)測(cè)微尺刻度面朝上固定在顯微鏡的載物臺(tái)上，注意不可放反。（2）標(biāo)定：將低倍鏡轉(zhuǎn)入光路，鏡臺(tái)測(cè)微尺有刻度的部分移至視野中央，調(diào)節(jié)焦距，當(dāng)清晰地看到鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡使目鏡測(cè)微尺與鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度相平行

18、。利用移動(dòng)鈕移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺所占的格數(shù)。（使目鏡測(cè)微尺的一條刻度線與鏡臺(tái)測(cè)微尺的一條刻度線相重合，再尋另一重合線，分別數(shù)出其間鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺所占的格數(shù)）（3）用同樣的方法，分別在高倍鏡和油鏡下對(duì)目鏡測(cè)微尺進(jìn)行標(biāo)定。（觀察時(shí)光線不宜過強(qiáng)，否則難以找到鏡臺(tái)測(cè)微尺的刻度，換高倍鏡和油鏡標(biāo)定時(shí)，務(wù)必十分細(xì)心，防止接物鏡壓壞鏡臺(tái)測(cè)微尺和損壞鏡頭）（4）計(jì)算：已知鏡臺(tái)測(cè)微尺每格長10m，根據(jù)下列公式即可分別計(jì)算出在不同放大倍數(shù)下，目鏡測(cè)微尺每格所代表的長度。目鏡測(cè)微尺每格長度（m）=10n/m n：兩重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺格

19、數(shù)m：兩重合線間接目測(cè)微尺格數(shù)3、微生物細(xì)胞大小的測(cè)量目鏡測(cè)微尺標(biāo)定完畢后，取下鏡臺(tái)測(cè)微尺，換上微生物標(biāo)本片，將其固定在載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到標(biāo)本片圖象，然后根據(jù)不同的微生物對(duì)象分別轉(zhuǎn)換到高倍鏡或油鏡下，用目鏡測(cè)微尺測(cè)量微生物細(xì)胞的直徑或?qū)捄烷L所占的格數(shù)，再依據(jù)所標(biāo)定的高倍鏡或油鏡下每一格的實(shí)際長度計(jì)算細(xì)胞的實(shí)際大小。通常測(cè)定對(duì)數(shù)生長期菌體來代表該菌的大小，為了盡量減小實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)在同一標(biāo)本片上測(cè)量1020個(gè)細(xì)胞，取其平均值作為該菌的大小。（二）微生物細(xì)胞濃度測(cè)定1、菌懸液的制備：以無菌生理鹽水將釀酒酵母培養(yǎng)物制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙骸?、加樣品：將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)

20、滴管將搖勻的酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室（注意取樣前要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生）。3、找計(jì)數(shù)室：加樣后靜止5min，然后將血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)（注意調(diào)節(jié)顯微鏡光線強(qiáng)弱，使菌體和計(jì)數(shù)室線條清晰）。4、顯微鏡計(jì)數(shù)：取左上、右上、左下、右下和中央5個(gè)中方格進(jìn)行計(jì)數(shù)。位于中方格邊線上的菌體一般只計(jì)上邊和右邊線上的（或只計(jì)左邊和下邊線上的）。如遇到酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞一半以上時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從上下兩個(gè)計(jì)數(shù)室中得到的平均數(shù)值來計(jì)算樣品的含菌量。5、清洗血球計(jì)數(shù)板：

21、使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水龍頭上用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察計(jì)數(shù)室內(nèi)是否有殘留菌體或其它沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。五、思考題1、根據(jù)你的體會(huì)，說說用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來自哪些方面？應(yīng)如何盡量減少誤差，力求準(zhǔn)確？2、能否用血球計(jì)數(shù)板在油鏡下對(duì)細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)？為什么？六、注意事項(xiàng)及其它說明測(cè)量完畢，換上原有的顯微鏡目鏡（或取出目鏡測(cè)微尺，目鏡放回鏡筒），用擦鏡紙將測(cè)微尺擦拭干凈后放回盒內(nèi)保存，并按照顯微鏡的使用和維護(hù)方法擦拭物鏡。 血球計(jì)數(shù)板使用完畢后及時(shí)洗滌，注意不要用尖銳的物體擦拭表面。實(shí)驗(yàn)四 培養(yǎng)基的制備與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌

22、握常用細(xì)菌培養(yǎng)基的配制方法。掌握高壓蒸汽滅菌的操作方法。2、 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備及材料 藥品：待配各種培養(yǎng)基的組成成分、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿等。 其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號(hào)筆、棉花等。三、實(shí)驗(yàn)原理、方法和手段 正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的多樣性，因而用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異，但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同。例如器皿的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培

23、養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相同。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟（一）玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。（二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過程1、液體培養(yǎng)基配制（1）稱量：一般可用0.01g天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品，先按培養(yǎng)基配方計(jì)算出各成分的用量然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。（2）溶解：將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要可用自來水或蒸餾水），用玻璃棒攪動(dòng)，加熱溶解。（3）定容：待全部藥品溶解后，倒入一量筒中

24、，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時(shí)，可預(yù)先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體積溶液，加入至培養(yǎng)基中。（4）調(diào)pH：一般用pH試紙測(cè)定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用1mol/L NaoH或1mol/L HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時(shí)，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時(shí)用PH試紙測(cè)試，直至達(dá)到所需pH為止。（5）過濾：用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基。一般無特殊要求時(shí)，此步可省去。2、固體培養(yǎng)基的配制 配制固體培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸

25、，再將稱好的瓊脂（1.52）加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分。（三）培養(yǎng)基的分裝 根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)，分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時(shí)，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。1、試管的分裝取一個(gè)玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時(shí)，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指及無名指夾佐玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。裝入試

26、管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15150 mm時(shí)，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度14左有為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時(shí)，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高15（約34mI），半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的13為宜。2、三角瓶的分裝用于振蕩培養(yǎng)微生物時(shí)，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液體培養(yǎng)基；若用于制作平板培養(yǎng)基用時(shí)，可在250 m1三角瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉（按2計(jì)算），滅菌時(shí)瓶中瓊脂粉同時(shí)被融化。（四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時(shí)為防止雜菌污染，則必須對(duì)

27、通入試管或三角瓶內(nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。1、試管棉塞的制作制棉塞時(shí)，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，鋪展于左手拇指和食指扣成的團(tuán)孔上，用右手食指將棉花從中央壓入團(tuán)孔中制成棉塞。然后直接壓入試管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折疊卷塞法制作棉塞。制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的23在試管內(nèi)，13在試管外。目前也有采用硅膠塞代替棉塞直接蓋在試管口上。將裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或硅膠塞的試管捆成一捆，外面包上一層牛皮紙。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基的名稱稱及配制日期，滅菌待用。2

28、、三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一層紗布，再塞在瓶口上。有時(shí)為了進(jìn)行液體振蕩培養(yǎng)加大通氣量，則可用8層紗布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅膠塞直接蓋在瓶口上。在裝好培養(yǎng)基并塞好棉塞或包扎八層紗布或蓋好硅膠塞的三角瓶口上，再包上一層牛皮紙并用線繩捆好，滅菌待用。（五）培養(yǎng)基的滅菌培養(yǎng)基經(jīng)分裝包扎后，應(yīng)立即按配制方法規(guī)定的滅菌條件進(jìn)行進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。（六）斜面和平板的制作1、斜面的制作將已滅菌裝有瓊脂培養(yǎng)基的試管，趁熱置于木棒或玻棒上，使成適當(dāng)斜度，凝固后即成斜面。斜面長度不超過試管長度l2為宜。如制作半團(tuán)體或固體深層培養(yǎng)基時(shí)，滅菌后則應(yīng)垂直放置至凝固。2、平板的制作將裝在三角瓶或試管中已滅菌

29、的瓊脂培養(yǎng)基融化后，待冷至50左右傾入無菌培養(yǎng)皿中。溫度過高時(shí)，皿蓋上的冷凝水太多；溫度低于50，培養(yǎng)基易于凝固而無法制作平板。平板的制作應(yīng)在火旁進(jìn)行，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部或試管，左手同時(shí)用小指和手掌將棉塞打開，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養(yǎng)皿蓋打開一縫，至瓶口正好伸入，傾入1015mL培養(yǎng)基，迅速蓋好皿蓋，置于桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)平皿，使培養(yǎng)基均勻分布于整個(gè)平皿中，冷凝后即成平板。（七）培養(yǎng)基的滅菌檢查滅菌后的培養(yǎng)基，一般需進(jìn)行無菌檢查。最好取出1-2管(瓶)，置于37溫箱中培養(yǎng)1-2天，確定無菌后方可使用。五、思考題1、為什么微生物實(shí)驗(yàn)室所用的三角瓶口或試管口都要塞上棉塞才能使用？2、

30、配制培養(yǎng)基時(shí)為什么要調(diào)節(jié)pH？3、高壓蒸汽滅菌為什么比干熱滅菌要求溫度低、時(shí)間短？六、注意事項(xiàng)及其它說明1、加水：首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面沒過加熱蛇管，與三角擱架相平為宜。切勿忘記檢查水位，加水量過少，滅菌鍋會(huì)發(fā)生燒干引起炸裂事故。2、裝料：放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌的物品。注意不要裝得太擠，以免妨礙蒸汽流通而影響滅菌效果。裝有培養(yǎng)基的容器放置時(shí)要防止液體溢出，三角瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包扎的紙而透入棉塞。3、加蓋：將蓋上與排氣孔相連的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，擺正鍋蓋，對(duì)齊螺口，然后以對(duì)稱方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣，

31、并打開排氣閥。4、排氣：打開電源加熱滅菌鍋，將水煮沸，使鍋內(nèi)的冷空氣和水蒸汽一起從排氣孔中排出。一般認(rèn)為當(dāng)排出的氣流很強(qiáng)并有噓聲時(shí)，表明鍋內(nèi)的空氣已排盡，沸騰后約需5分鐘。5、升壓：冷空氣完全排盡后，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，鍋內(nèi)壓力開始上升。6、保壓：當(dāng)壓力表指針達(dá)到所需壓力時(shí)，控制電源，開始計(jì)時(shí)并維持壓力至所需的時(shí)間。如本實(shí)驗(yàn)中采用0.1Mpa，121.5，20分鐘滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力，因此鍋內(nèi)的冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)閉排氣閥，維持所需壓力。7、降壓：達(dá)到滅菌所需的時(shí)間后，切斷電源，讓滅菌鍋溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”后，方可打開排氣閥，排盡余下的蒸汽，旋松螺栓

32、，打開鍋蓋，取出滅菌物品，倒掉鍋內(nèi)剩水。壓力一定要降到“0”后，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基或試劑由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼傷操作者。8、無菌檢查：將已滅菌的培養(yǎng)基放入37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，檢查無雜菌生長后，即可使用。實(shí)驗(yàn)五 環(huán)境中微生物的檢測(cè) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?證明實(shí)驗(yàn)室環(huán)境與體表存在微生物。比較來自不同場(chǎng)所與不同條件下細(xì)菌的數(shù)量和類型。觀察不同類群微生物的菌落形態(tài)特征。體會(huì)無菌操作的重要性。二、實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備及材料 培養(yǎng)基：肉膏蛋白胨瓊脂平板。 儀器或其他用具：無菌水，接種環(huán)，試管架，酒精燈，記號(hào)筆，廢物缸等。三、實(shí)驗(yàn)原理

33、、方法和手段 平板培養(yǎng)基含有細(xì)菌生長所需要的營養(yǎng)成分，當(dāng)取自不同來源的樣品接種于培養(yǎng)基上，在適宜溫度下培養(yǎng)1-2d內(nèi)每一菌體即能通過很多次細(xì)胞分裂而進(jìn)行繁殖，形成一個(gè)可見的細(xì)胞群體集落，稱為菌落。每一種細(xì)菌所形成的菌落都有它自己的特點(diǎn)，例如菌落的大小，表面干燥或濕潤、隆起或扁平、粗糙或光滑，邊緣整齊或不整齊，菌落透明或半透明或不透明，顏色以及質(zhì)地疏松或緊密等。因此，可通過平板培養(yǎng)來檢查環(huán)境中細(xì)菌的數(shù)量和類型。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟1、寫標(biāo)簽任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在動(dòng)手操作前均需首先將器皿用記號(hào)筆做上記號(hào)，寫上班級(jí)、姓名、日期，本次實(shí)驗(yàn)還要寫上樣品來源(如實(shí)驗(yàn)室空氣或無菌室空氣或頭發(fā)等)，字盡量小些，寫在皿

34、底的一邊，不要寫在當(dāng)中，以免影響觀察結(jié)果。培養(yǎng)皿的記號(hào)一般寫在皿底上。如果寫在皿蓋上，同時(shí)觀察兩個(gè)以上培養(yǎng)皿的結(jié)果，打開皿蓋時(shí)，容易混淆。2、實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌檢查（1）空氣 將一個(gè)肉膏蛋白胨瓊脂平板放在當(dāng)時(shí)做實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室，移去皿蓋，使瓊脂培養(yǎng)基表面暴露在空氣中；將另一肉膏蛋白胨瓊脂平板放在無菌室或無人走動(dòng)的其他實(shí)驗(yàn)室，移去皿蓋。lh后蓋上兩個(gè)皿蓋。3、人體細(xì)菌的檢查（1）手指（洗手前與洗手后）分別在兩個(gè)瓊脂平板上標(biāo)明洗手前與洗手后（班級(jí)、姓名日期）。移去皿蓋，將未洗過的手指在瓊脂平板的表面，輕輕地來回劃線，蓋上皿蓋。用肥皂和刷子，用力刷手，在流水中沖洗干凈，干燥后，在另一瓊脂平板表面來回移動(dòng)，蓋上皿

35、蓋。（2）頭發(fā) 在揭開皿蓋的瓊脂平板的上方，用手將頭發(fā)用力搖動(dòng)數(shù)次，使細(xì)菌降落到玻脂平板表面，然后蓋上皿蓋。（3）咳嗽 將去皿蓋的瓊脂平板放在離口約68cm處，對(duì)著瓊脂表面用力咳嗽（注意是干咳，不要有太大的氣流和口水），然后蓋上皿蓋。4、將所有的瓊脂平板翻轉(zhuǎn)，使皿底朝上，放37培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12d。五、思考題1、比較各種來源的樣品，哪一種樣品的平板菌落數(shù)與菌落類型最多？2、人多的實(shí)驗(yàn)室與無菌室(或無人走動(dòng)的實(shí)驗(yàn)室)相比，平板上的菌落數(shù)與菌落類型有什么區(qū)別？你能解釋一下造成這種區(qū)別的原因嗎？3、洗手前后的手指平板，菌落數(shù)有無區(qū)別？4、通過本次實(shí)驗(yàn)，在防止培養(yǎng)物的污染與防止細(xì)菌的擴(kuò)散方面，你學(xué)到些什

36、么？有什么體會(huì)。六、注意事項(xiàng)及其它說明結(jié)果記錄方法（1）菌落計(jì)數(shù) 在劃線的平板上，如果菌落很多而重疊，則數(shù)平板最后1/4面積內(nèi)的菌落數(shù)。不是劃線的平板，也一分為四，數(shù)l/4面積的菌落數(shù)。（2）根據(jù)菌落大小、形狀、高度、干濕等特征觀察不同的菌落類型。但要注意，如果細(xì)菌數(shù)量太多，會(huì)使很多菌落生長在一起，或者限制了菌落生長而變得很小，因而外觀不典型，故觀察菌落的特點(diǎn)時(shí)，要選擇分離得很開的單個(gè)菌落。菌落特征描寫方法如下：大?。捍蟆⒅?、小、針尖狀。可先將整個(gè)平板上的菌落粗略觀察一下，再?zèng)Q定大、中、小的標(biāo)準(zhǔn)。顏色：黃色、金黃色、灰色、乳白色、紅色、粉紅色等。干濕情況：干燥、濕潤、粘稠。形態(tài)： 圓形、不規(guī)則

37、等。高度：扁平、隆起、凹下。透明程度：透明、半透明、不透明。邊緣：整齊、不整齊。實(shí)驗(yàn)六 水中細(xì)菌總數(shù)檢測(cè) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的方法。了解水源水的平板菌落計(jì)數(shù)的原則。2、 實(shí)驗(yàn)主要設(shè)備及材料 培養(yǎng)基：肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板，無菌水。 儀器或其他用具：滅菌三角燒瓶，滅菌的帶玻璃塞瓶，移液槍，滅菌槍頭，滅菌試管，滅菌涂布器等。三、實(shí)驗(yàn)原理、方法和手段 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用平板菌落計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)定水中細(xì)菌總數(shù)。由于水中細(xì)菌種類繁多，它們對(duì)營養(yǎng)和其他生長條件的要求差別很大，不可能找到一種培養(yǎng)基在一種條件下，使水中所有的細(xì)菌均能生長繁殖，因此，以一定的培養(yǎng)基平板上生長出來的菌落，計(jì)算出來的水中細(xì)菌總數(shù)僅是一種近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟1、水樣的采?。?