三、基因工程的基本條件-工具酶和細胞.ppt

1、Genetic Engineering,1.基因工程概述 2.基因工程的基礎(chǔ)知識與基本技術(shù) 3.基因工程所需基本條件 4.基因工程的操作過程 5.目的基因的獲取 6.克隆基因的表達 7.轉(zhuǎn)基因生物技術(shù),3 基因工程的基本條件,C 用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細胞,B 用于基因克隆的載體,A 用于核酸操作的工具酶,A 用于核酸操作的工具酶,3 基因工程的基本條件,限制性核酸內(nèi)切酶,DNA連接酶,DNA聚合酶,核酸酶,核酸修飾酶,限制性核酸內(nèi)切酶,限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能,識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈,主要存在于原核細菌中，幫助細菌限制外來DNA的入侵,細菌的限制與修飾作用

2、,hsd R：編碼限制性核酸內(nèi)切酶,hsd M：編碼限制性甲基化酶,hsd S：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達,1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出,Hind II和Hind III,限制性內(nèi)切酶將侵入細菌體內(nèi)的外源DNA切成小片斷,1）限制（Restriction,細菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識別切割,2）修飾（Modification,Dam甲基化酶,GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基,Dcm甲基化酶,CCAGG或CCTGG序列在第二個C上C5位置上引入甲基,限制性核酸內(nèi)切酶,限制性核酸內(nèi)切酶的類型,主要特性 I 型 II 型

3、 III 型,蛋白結(jié)構(gòu),異源三聚體,同源二聚體,異源二聚體,切割位點,距識別序列1kb處,識別序列內(nèi)或附近,距識別序列下游,隨機性切割,特異性切割,24-26bp處,首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年從大腸桿菌 B株和 K株分離的,1）識別位點序列,EcoB： TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC,I型限制性內(nèi)切酶,如 EcoB和 EcoK,未甲基化修飾的特異序列,需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸,3）作用機理,在距離特異性識別位點約10001500 bp處隨機切開一條單鏈,Recognize site,cut,1-1.5kb,2）切割位點

4、,首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年從流感嗜血菌中分離出來,分離的第一個酶是Hind,型限制性內(nèi)切酶,限制-修飾系統(tǒng)分別由限制酶與修飾酶兩種不同酶分子組成,分子質(zhì)量小,能識別DNA的特殊序列,種類多,在基因工程中起重要作用,III類限制性內(nèi)切酶,在完全肯定的位點切割DNA，但反應(yīng)需要ATP、 Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸,在基因工程操作中用途不大,EcoP1: AGACC,EcoP15: CAGCAG,限制性核酸內(nèi)切酶,限制性核酸內(nèi)切酶的命名,屬名 種名 株名,H i n d III H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血

5、流感桿菌d株,同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶,限制性核酸內(nèi)切酶,II 型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性,識別雙鏈DNA分子中4 - 8對堿基的特定序列,大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側(cè),識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu),5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的識別序列,EcoR I的切割位點,EcoRI等產(chǎn)生的5粘性末端,EcoRI 37,退火 4-7,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P,Pst

6、I等產(chǎn)生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,PstI 37,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,連接便利,粘性末端的意義,i）不同的DNA雙鏈,只要粘性末端堿基互補就可以連接,ii）同一個DNA分子內(nèi)連接,通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子,這比連接兩個平齊末端

7、容易的多,補平成平齊末端,凸出的3端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端,5末端標記,凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶進行32P標記,粘性末端可以用DNA聚合酶補平成平齊末端,PvuII等產(chǎn)生的平頭末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,PvuII 37,識別位點的序列相同的限制性內(nèi)切酶,同裂酶（Isoschizomers,完全同裂酶,識別位點和切點完全相同。 如Hind 和Hsu I,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3

8、 3-TTCGAA-5,識別位點相同，但切點不同。 如Xma I 和 Sma I,不完全同裂酶,識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等,同尾酶(Isocaudamers,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho,U代表嘌呤；Y代表嘧啶,5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點一般不能再被原來的酶識別,5-G 3-CCTAG,

9、GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl,5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl,Sau 3A,II 型限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列與DNA的切割,限制酶識別序列與DNA的來源無關(guān),不具有種的特異性 識別序列的長短涉及對DNA分子切割的頻率 識別序列的相鄰序列效應(yīng) 限制酶的偏愛現(xiàn)象 限制酶的星號活性,限制性核酸內(nèi)切酶,影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素,DNA樣品的純度,蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶,加大反應(yīng)總體積,延長反應(yīng)時間,限制性核酸內(nèi)切酶,影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素,DNA樣品的甲基化

10、程度,大腸桿菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位,引入甲基，受其影響的酶有Bcl I、MboI等，但BamH I,Bgl II、Sau3A I不受影響,大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列,中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoR II等,哺乳動物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,限制性核酸內(nèi)切酶,影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素,酶活性單位：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng) 1 小時，完全水解 1 mg 標 準DNA所需的酶活性定為1U,酶用量： 當DNA樣品確定后，為完全切割此DNA，酶的用量視酶的催化活性而定,容積活性：1ul酶溶液中

11、具有的酶活性單位。根據(jù)完全切割1 g DNA所需酶量來換算,限制性核酸內(nèi)切酶,影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素,核酸內(nèi)切酶的緩沖液性質(zhì),高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強度、極端pH值等,會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即,所謂的Star activity現(xiàn)象,EcoR I在正常條件下識別并切割5GAATTC3序列，但在甘,油濃度超過50%（v/v）時，也可切割5PuPuATPyPy3或者,5AATT3,五種緩沖液：A B H M L，每種酶只有在最適的反應(yīng)緩沖液中才具有最強的催化活性,影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素,酶切消化反應(yīng)的溫度,不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多

12、數(shù)是37 oC，少數(shù)要求40-65 oC,限制性核酸內(nèi)切酶,II 型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作,大部分II 型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,0 - 150 mM,DTT,1 mM,0 - 50 mM 低鹽酶,100 mM 中鹽酶,150 mM 高鹽酶,Volume,20 - 100 ml,T T,37 1 - 1.5 hr,MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和離子強度； Tris-HCl： 維持pH； 二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定,限制性核酸內(nèi)切酶,II 型

13、限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作,II 型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解,對鹽濃度要求不同的酶，可采取下列方法,使用較貴的酶的鹽濃度，加大便宜酶的用量，同時酶解,低鹽酶先切，然后補加鹽，高鹽酶再切,一種酶先切，然后更換緩沖液，另一種酶再切,對鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時酶切,DNA連接酶,DNA連接酶的基本性質(zhì),修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵,DNA連接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

14、 5,nick,nick,1）必須是兩條雙鏈DNA,2）DNA3端有游離的-OH， 5端有一個磷酸基團（P,3）需要能量,動物或噬菌體中：ATP 大腸桿菌中： NAD,連接條件,DNA連接酶,DNA連接酶的基本性質(zhì),大腸桿菌DNA連接酶：只能催化雙鏈DNA的互補黏性末端， 以NAD+為能量 T4噬菌體連接酶：黏性、平末端均可連接，以ATP為能量,1. ATP（NAD+)提供激活的AMP,連接反應(yīng)的機理,2. ATP與連接酶形成共價“連接酶-AMP”復(fù)合物，并釋放出焦磷酸PPi,3. AMP與連接酶的賴氨酸-氨基相連,OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2,H3N,AMP,ATP,PP

15、i,4. AMP隨后從連接酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移到DNA一條鏈的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”復(fù)合物,OH,HO-P,AMP,OH,O-P,AMP,5. 3-OH對磷原子作親核攻擊，形成磷酸二脂鍵，釋放出AMP,DNA連接酶,DNA連接酶的基本性質(zhì),連接多個平頭雙鏈DNA分子,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA連接酶,DNA連接酶,平頭雙鏈DNA片段的連接操作,從分子動力學的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多 提高

16、平頭末端連接效率的方法包括,加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接,加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機會,加入10% PEG8000，促進大分子之間的有效作用,加入單價陽離子（NaCl），最終濃度150-200 mM,DNA連接酶,DNA連接酶的反應(yīng)條件,Tris-HCl,50 - 100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5 - 1 mM,DTT,5 mM,Volume,10 - 20 ml,T T,4 - 15 4 - 16 hr,1 U DNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15 反應(yīng) 1 小時,完全連接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶

17、量,增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現(xiàn)象,1. 插入片段與載體的濃度比例,2. 反應(yīng)溫度,12.5,五影響連接反應(yīng)的因素,1020倍,一般1416,DNA連接酶,3. 酶用量,基因工程中常用的DNA聚合酶,大腸桿菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修飾過的T7 DNA聚合酶 6. 逆轉(zhuǎn)錄酶,DNA聚合酶,1. 共同特點,把dNTPs連續(xù)地加到引物的3OH端,2. 主要區(qū)別,T7 DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個dNTPs而不從模板上掉下來,常用的DNA聚合酶的特點,持續(xù)合成能力和外切酶活性不同,常用DNA

18、聚合酶的特性比較,DNA聚合酶,大腸桿菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I,53的DNA聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活性,大腸桿菌DNA聚合酶 I的基本性質(zhì),3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-OH,5 ppp dNTP Mg2,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNA pol I,DNA聚合酶,大腸桿菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I,切口前移標記法,大腸桿菌DNA聚合酶 I 的基本用途,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

19、-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+ 5 dNTP 5 ppp dA（a-32P-dATP,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Nick translation,制備32P標記的探針,DNase I,DNA pol I,DNA聚合酶,大腸桿菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow,Klenow酶的基本性質(zhì),大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，

20、獲得N端,三分之二的大肽段，即為Klenow酶,Klenow酶仍擁有53的DNA聚合酶活性和35的核,核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性,DNA聚合酶,大腸桿菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow,Klenow酶的基本用途,補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5粘性末端,DNA片段的同位素末端標記,cDNA第二鏈的合成,雙脫氧末端終止法測定DNA序列,DNA聚合酶,大腸桿菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow,Klenow酶的基本用途：補平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5粘性末端,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T

21、-C 5,Klenow,dATP dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,DNA聚合酶,大腸桿菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow,Klenow酶的基本用途： DNA片段的同位素末端標記,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,a-32P-pppdA dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G

22、-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,3隱蔽末端的DNA片斷,Klenow fragment補平,根據(jù)末端的順序選擇一種 -32P-dNTPs,末端標記的DNA,限制性內(nèi)切酶切,5-G3 3-CTTAA5,5-GAA3 3-CTTAA5,5-GAATT3 3-CTTAA5,5-G3 3-CCTAG5,5-GG3 3-CCTAG5,5-GGATC3 3-CCTAG5,EcoR I,BamH I,32P-dATP,32P-dGTP,25oC 1h,mRNA,cDNA第一鏈,逆轉(zhuǎn)錄,cDNA第二鏈,klenow,5,3,3,5,5,3,引物,Klenow酶的基本用途

23、： cDNA第二鏈的合成,DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶,T4-DNA酶的基本特性,在無dNTP時，可以從任何3-OH端外切,在只有一種dNTP時，外切至互補核苷酸暴露時停止,在四種dNTP均存在時，聚合活性占主導(dǎo)地位,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的3粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C 5,T4-DNA聚合酶,5 G-C-T-C- OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO

24、-C-C-T-C 5,注意：該酶也能降解雙鏈DNA，只是其活性比單鏈降解活性低很多,DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶,T4-DNA聚合酶的基本用途： DNA片段的同位素末端標記,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+ 5 ppp dN 5 ppp dA（a-32P-dATP,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-OH,HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,T4-DNA pol,T4-DNA pol,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C

25、-C-T-C-A 5,酶切中間產(chǎn)生兩個末端標記,加入某種32P-dNTP和dNTPs,T4 DNA聚合酶 （35外切,DNA酶切片斷,T4 DNA聚合酶 （53聚合,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,內(nèi)切酶切,無dNTPs,1）來源,從T7噬菌體感染大腸桿菌細胞中純化出來的，由兩個亞基組成,T7基因5編碼的大亞基,有53聚合酶和35外切酶活性,大腸桿菌編碼的小亞基,硫氧還蛋白。 增加大亞基對模板的親和性,DNA聚合酶,T7-DNA聚合酶,T7 DNA聚合酶的特點,持續(xù)合成能力強,一旦與模板結(jié)合就會不間斷地合成互補鏈,35外切酶活性高,單鏈和雙鏈都能

26、降解,不受DNA二級結(jié)構(gòu)的影響,其它DNA聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)的阻礙,進行末端標記,以大分子量DNA為模板的合成,如M13,補平隱蔽末端,T7 DNA聚合酶的用途,取代合成法標記3末端,與T4 DNA聚合酶相同,合成補平3隱蔽末端； 水解修平3突出末端,修飾后的T7 DNA聚合酶,1）T7DNA聚合酶的化學修飾,去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍,2）修飾后的T7 DNA聚合酶的用途,DNA測序,雙脫氧法,標記DNA 3隱蔽末端,更有效地補平末端,DNA聚合酶,依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶,反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈,3AAAAAAAAAA

27、AAAA,5mRNA,反轉(zhuǎn)錄酶,Mg2+ dNTP,5TTTTTTTTTTTT oligo (dT) 12-18,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,5TTTTTTTTTTTTTT,3cDNA,DNA聚合酶,依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶,反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈,反轉(zhuǎn)錄酶,3 RNA,5 DNA,3,5,3 RNA,5 DNA,3,5,反轉(zhuǎn)錄酶,5 DNA,3,DNA聚合酶,TaqDNA聚合酶,基本特性： 53的DNA聚合酶活性 53的核酸外切酶活性 耐高溫78-94度,用途： PCR擴增 DNA序列測定,核酸酶,單鏈核酸外切酶：核酸外切酶V

28、II（ExoVII,大腸桿菌的核酸外切酶VII不需要Mg2,ExoVII,3,5,3,5,3,5,3,5,核酸酶,雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII,ExoVII,3,5,3,5,Mg2,3,5,3,5,大腸桿菌的核酸外切酶 III 特異性地從3 端外切,核酸酶,雙鏈核酸外切酶：l 核酸外切酶（ lExo,lExo,3,5,3,5,Mg2,l核酸外切酶特異性地從5 端外切,3,5,3,5,核酸酶,單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本特性：來自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae,Zn2+必需,最適pH范圍為4.0 - 4.3,需要NaCl 10 - 300 m

29、M,降解單鏈DNA的速度比降解雙鏈DNA快75000倍,降解單鏈DNA的速度比降解單鏈RNA快7倍,核酸酶,單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切單鏈DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,S1,Zn2,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,5 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 3,5 dNMPs 或 5 NMPs,核酸酶,單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本反應(yīng)：內(nèi)切帶缺口或缺刻的雙鏈DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G C-T

30、-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A 5,nick,gap,S1,Zn2,5 G-C-T-C-A-G,3 C-G-A-G-T-C,T-G-G-A-G-T 3,A-C-C-T-C-A 5,核酸酶,單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶,基本特性：來自艾氏交替單胞菌（A.espejiana,Ca2,5 dNMPs 或 5 NMPs,ssDNA or RNA,Ca2,Ca2,核酸酶,單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31核酸酶,Bal31核

31、酸酶的基本用途：誘發(fā)DNA突變,EcoRI,A,B,C,EcoRI,EcoRI,B,C,A,Bal31,B,C,A,環(huán)化,A,C,核酸修飾酶,末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT,TdT的基本特性：來自小牛胸腺,催化DNA在其3-OH末端加NTP,不需要模板的DNA聚合酶，隨機摻入dNTPs,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Mg2+ dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,TdT的基本特性,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+ dATP,5 p,3 HO AAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAA OH 3,p 5,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+ dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,AAAAAAAAAAA,核酸修飾酶,堿性磷酸單酯酶,來自小牛胸腺的堿性磷酸單酯酶（CIP,來自大腸桿菌的堿性磷酸單酯酶（BAP,5 p,OH 3,DNA or RNA,5 ppp dN,5 pppN,BAP / CIP,OH 3,5 HO,5 HO dN,5 HO N,核酸修飾酶,T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP,T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5-OH上加磷酸,5 HO,3 HO,OH 3,OH 5,T4-PNP,Mg2+ pppA