第二章 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用生物反應器.ppt

1、第二章 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)和專用生物反應器,動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術,所謂動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術（large-scale culture technology）是指在人工條件下（設定ph、溫度、溶氧等），在細胞生物反應器（bioreactor）中高密度大量培養(yǎng)動物細胞用于生產(chǎn)生物制品的技術。 目前可大規(guī)模培養(yǎng)的動物細胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細胞及人二倍體細胞、cho（中華倉鼠卵巢）細胞、BHK-21(倉鼠腎細胞)、Vero細胞(非洲綠猴腎傳代細胞，是貼壁依賴的成纖維細胞)等，并已成功生產(chǎn)了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產(chǎn)品。,第一

2、節(jié)、常用的培養(yǎng)方法 第二節(jié)、動物細胞培養(yǎng)的操作方式 第三節(jié)、細胞培養(yǎng)過程的放大 第四節(jié)、動物細胞培養(yǎng)生物反應器,動物細胞工程,通常采用的技術手段,人耳鼠,2001年，一只特別的活老鼠在北京引起轟動這是有著一對紅眼睛的、尾巴長長的、渾身沒毛的小白鼠。值得一提的是，這只小白鼠的背上，竟長著一只幾乎與身子一般大小的“人耳”。這只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民醫(yī)院副院長、整復外科主任曹誼林教授利用組織工程技術復制出來的。,在京展出的數(shù)天，盡管門票高達20元，但還是有將近20萬人，心甘情愿地掏錢一睹“人耳鼠”的風采。,人耳鼠的出現(xiàn)，透露了怎樣的信息？,“人耳鼠”再出風頭,華南虎是我國特有的虎種。華

3、南虎于1996年被國際自然保護聯(lián)盟列為極度瀕危的十大物種之一。到目前為止，中國存活的圈養(yǎng)華南虎僅為70只，其中包括正在南非野化的2只。國內(nèi)動物園圈養(yǎng)的華南虎只有68只，散布在全國18家城市動物園中。,除了在恢復華南虎棲息地、生存環(huán)境等方面做出積極努力外，我們是否可以借助現(xiàn)代生物技術的力量，幫助華南虎種群數(shù)量的恢復？,華南虎,人工關節(jié)軟骨再生,1.第一次手術: 從病人關節(jié)軟骨中未 受力的部分，取出一片約為葡萄干大小的健康軟骨組織。 2.分離軟骨細胞并經(jīng)三星期的體外 培養(yǎng)，使細胞數(shù)增加約1020倍。 3.第二次手術: 清理軟骨受損的部分，從下方骨頭部位取出一片約與傷口大小相同的骨膜，縫在傷口上方，

4、再將軟骨細胞注射到骨膜下方。,結果: 經(jīng)過復健一年后即可恢復正常的生活。,在生物技術中，人們已廣泛地圍繞著細菌、酵母、絲狀真菌等微生物的大量培養(yǎng)來生產(chǎn)各種酶、抗生素、蛋白質等產(chǎn)物。然而，許多有重要價值的蛋白質等生物物質，必須借助于動物細胞的培養(yǎng)來獲得，例如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體等，如下頁表所示的是一些已實現(xiàn)工業(yè)化和正在研究開發(fā)的產(chǎn)品。,動物細胞培養(yǎng)的必要性,動物細胞培養(yǎng)的產(chǎn)物,相關過程和關鍵技術問題,1、基因工程和細胞工程的發(fā)展 2、大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)技術和生物反應器的開發(fā)。 3、產(chǎn)品的分離濃縮和提純技術的提高。,動物細胞體外培養(yǎng)的歷史可追溯到1907年，美國生物學家Harrison在無

5、菌條件下，以淋巴液為培養(yǎng)基成功地在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織達數(shù)周，創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)法。,大規(guī)模的動物細胞培養(yǎng)開始于上世紀60年代，經(jīng)過多年來的研究，人類對動物細胞培養(yǎng)技術進行了大量的研究開發(fā)，取得了很大的進展。盡管如此，目前的技術水平還遠不能滿足細胞生物產(chǎn)品研究和生產(chǎn)的要求，隨著動物細胞培養(yǎng)技術的應用日趨廣泛，已顯示出很廣闊的發(fā)展前景。,利用動物細胞培養(yǎng)技術生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術產(chǎn)品市場份額的50%。 大量資料表明，生物技術藥物是當前新藥開發(fā)的重要領域，生物技術制藥工業(yè)是下一個10年制藥工業(yè)的重要新門類，期間將有數(shù)百種生物技術新藥上市。目前,動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術水平的提高主要集中

6、在培養(yǎng)規(guī)模的進一步擴大、優(yōu)化細胞培養(yǎng)環(huán)境、改變細胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率與保證其質量上。,表 動物細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展,動物細胞形態(tài) (1)成纖維細胞型(fibrlblast或mechanocyte type)這種細胞形態(tài)與體內(nèi)成纖維細胞形態(tài)相似故而得名。細胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有圓形核，胞質向外伸出23個長短不同的突起。細胞群常借原生質突連接成網(wǎng)，生長時呈放射狀、漩渦或火焰狀走行。除真正的纖維細胞外，凡由中胚層間充質來源的其他組織細胞，如血管內(nèi)皮、心肌、平滑肌、成骨細胞等，也多呈成纖維細胞形態(tài)。實際上很多所謂成纖維細胞并無產(chǎn)生纖維的能力，只是一種習慣上概括的稱法。,(2)上皮細胞型(ep

7、ithilium cell type) 這種細胞呈扁平的不規(guī)則三角形，中央有圓形核，生長時常彼此緊密連接單層細胞片，起源于外胚層和內(nèi)胚層組織的細胞，如皮膚表皮及衍生物(汗腺、皮脂腺等)。腸管上皮、肝、胰和肺泡上皮細胞。培養(yǎng)時皆呈上皮型。,(3)游走細胞型(wondering cell type) 這種細胞的培養(yǎng)需要在支持物上生長，一般不連接成片，細胞胞質經(jīng)常出現(xiàn)偽足或突起，呈活躍的游走和變形運動，速度快而且方向不規(guī)則。此型細胞不很穩(wěn)定，有時亦難和其他型細胞相區(qū)別，在一定條件下，如培養(yǎng)基化學性質變動等，它們也可能變?yōu)槌衫w維細胞型。,(4)多形性細胞型(polymorphic cell type)

8、 除上述三種細胞外，還有一些組織和細胞，如神經(jīng)組織的細胞等，難以確定它們的穩(wěn)定形態(tài)，可統(tǒng)歸多形性細胞。 上述這四種細胞形態(tài)均屬于貼壁依賴型細胞，培養(yǎng)這類細胞時，常需貼附在支持物上生長。但由于培養(yǎng)環(huán)境的變化，細胞形態(tài)常發(fā)生改變。 (5)懸浮型細胞 這類細胞常呈圓形，不貼附在支持物上，呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)生長。如血液細胞，淋巴組織細胞及腫瘤細胞。培養(yǎng)這類細胞也可采用微生物培養(yǎng)的方法進行懸浮物培養(yǎng)。,（a）成纖維細胞型；（b）上皮細胞型； （c）游走細胞型；（d）多形性細胞型,圖 動物細胞形態(tài),單克隆抗體,哺乳動物細胞中有一套復雜的防御系統(tǒng)保護自己不受有毒物質和病原物的侵害，其中一部分防御反應就是淋巴細胞經(jīng)

9、誘導產(chǎn)生特異的蛋白，這些蛋白可以在其他免疫系統(tǒng)蛋白的幫助下與外來物質結合，并抵消其生物學功能。這些特異的蛋白，就是抗體；相對于抗體，誘發(fā)產(chǎn)生抗體的外來物質即稱為抗原。 抗體最早是由德國微生物學家貝林發(fā)現(xiàn)的，它們存在于人和脊椎動物的血清之中，是這些生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的重要組成成分。由于抗體分子具有極其精確的結合特異性，可以識別各種不同的抗原，還可以激活細胞的其他防衛(wèi)系統(tǒng)以消滅抗原，因此抗體在基礎研究和臨床診斷中獲得了廣泛的重視和應用。隨著雜交瘤技術、蛋白質工程和轉基因技術等技術的發(fā)展，抗體已逐步在疾病治療等應用領域顯示出越來越廣闊的應用前景。,抗體,由B細胞產(chǎn)生的免疫球蛋白，它能識別抗原的某一特定

10、位點?？贵w分子由兩個完全相同的重鏈分子以及兩個完全相同的輕鏈分子組成。存在于人或哺乳動物的血清之中。,抗原,如前所述，抗體分子是免疫系統(tǒng)反應的一個重要組分，因為抗體分子可以識別各種不同的外來抗原，同時可激活宿主的防衛(wèi)系統(tǒng)。 對于一個免疫刺激（有毒物質或病原物侵入，即抗原），每一個淋巴細胞都會合成并分泌一種單個的抗體，這些抗體可以高度特異地識別免疫抗原的特定區(qū)域，也就是抗原決定簇。由于一個抗原通常都有幾個不同的抗原決定簇，因此每個免疫淋巴細胞都可能產(chǎn)生一種針對某一個抗原決定簇的抗體，這些由同一抗原而產(chǎn)生的不同的抗體統(tǒng)稱為多克隆抗體。,有毒物質或病原物侵入，即抗原 指誘導產(chǎn)生抗體的物質。,多克隆抗

11、體,在一個血清樣品中包含了對同一抗原分子上不同抗原決定簇的多種抗體。,單克隆抗體,由雜交瘤細胞系產(chǎn)生的針對某一特定抗原決定簇的單一類型的抗體。,抗體,動物細胞培養(yǎng)一般步驟,放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng),動物細胞培養(yǎng)過程示意圖,動物細胞培養(yǎng)的過程,動物細胞培養(yǎng)的環(huán)境,動物細胞的生長、繁殖和代謝等生理性質在很大程度上受到各種環(huán)境因素的影響。為了使動物細胞的培養(yǎng)處于最佳狀態(tài)，了解環(huán)境因素對其影響無疑是很重要的，影響動物細胞生長、繁殖的環(huán)境因素很多，主要有溫度、PH值、營養(yǎng)成分、溶氧、氣體環(huán)境、滲透壓以及其他因素。,溫 度,細胞在體外生存的基本條件之一，來源不同的動物細胞，其最適的生長溫度是不盡相同的，例

12、如昆蟲細胞的最適溫度是25-28，人和哺乳動物的細胞的最適溫度是37.細胞代謝強度與溫度成正比，高于最適溫度范圍，細胞的正常代謝和生長將會受到影響，甚至導致死亡?？偟膩碚f，動物細胞對低溫的耐受力比對高溫的耐受力強，如溫度升至45時，1h內(nèi)人和哺乳動物細胞將被殺死；相反，降低細胞置于25-35時，細胞仍能生長，但速度減慢，并維持長時間不死，甚至于放在4，數(shù)小時后再置于37培養(yǎng)，細胞仍能繼續(xù)生長。,PH 值,合適的PH值是細胞生存的必要的條件之一。動物細胞合適的PH值一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6時都對細胞產(chǎn)生不利的影響，嚴重時可導致細胞退變或死亡。不同的細胞對PH值也有不同的要求，

13、原代培養(yǎng)細胞對PH值的變化耐受性差，傳代細胞對PH值變化的耐受性較強。而對于同一種細胞，增長期和維持期的最適PH也不盡相同，對于大多數(shù)細胞來說，偏堿性環(huán)境比酸性環(huán)境更有利于細胞的生長。,營養(yǎng)成分,細胞的生長、繁殖以及產(chǎn)物的合成都必須從環(huán)境中攝取各種營養(yǎng)物質，以合成細胞物質及在新陳代謝中起調節(jié)作用。這些營養(yǎng)物質包括碳源、氮源、氨基酸、無機鹽、微量元素、生長因子等。,溶氧及氣體環(huán)境,滲透壓等其它因素,其它環(huán)境條件,培養(yǎng)器皿,動物細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面為什么要光滑、無毒？ 在培養(yǎng)過程中，如何才能保持無菌與無毒的環(huán)境？,培養(yǎng)基的組成,培養(yǎng)基是維持體外細胞生存和生長的基本溶液，是組織細胞培養(yǎng)最重要的條件。用于

14、動物細胞的培養(yǎng)基可以分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩 大類。,天然培養(yǎng)基是使用最早、最為有效的動物細胞培養(yǎng)基，它主要取自于動物體液或從動物組織分離提取而得，其優(yōu)點是營養(yǎng)成分豐富、培養(yǎng)效果良好；缺點是成分復雜、個體差異大、來源有限。,天然培養(yǎng)基的種類有很多，包括生物性液體（如血清）、組織浸出液（如胚胎浸出液）、凝固劑（如血漿）等。,血液組成：紅細胞、白細胞、血小板和血漿。 高速離心，分三層：上層為血漿-40%多。 血漿冷凍到-30度，離心，分層：上層為血清，下層為雜蛋白（少）。,血清,組織細胞培養(yǎng)中最常用的天然培養(yǎng)基是血清，這是因為血清中含有包括大分子的蛋白質和核酸等豐富的營養(yǎng)物質，對促進細胞生長繁

15、殖、粘附及中和某些物質的毒性起著一定的作用。用于組織細胞培養(yǎng)的血清的種類很多，其來源主要是動物，有小牛血清、胎牛血清、馬血清、兔血清以及人血清等，最廣泛使用的是小牛血清和胎牛血清。優(yōu)質的血清外觀應為透明、無溶血、淡黃色、無沉淀物。,血漿,組織浸出液,血漿不僅可用來支持培養(yǎng)組織塊，而且還供給細胞生長營養(yǎng)物質，但由于血漿很容易發(fā)生傳染，目前已很少單獨使用。一般使用的是禽類血漿。,組織浸出液常用的是胚胎浸出液（如雞胚浸出液），它的主要成分含有大分子核蛋白和小分子的氨基酸，有促進細胞生長的作用。,水解乳蛋白,水解乳蛋白是常用的一種天然培養(yǎng)基，是由乳白蛋白經(jīng)水解而制得，氨基酸的含量較高。一般配制成0.5

16、%的溶液，或與合成培養(yǎng)基以1：1共同使用。,合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質對細胞體內(nèi)生存環(huán)境中各種已知物質在體外人工條件的模擬，經(jīng)過反復實驗篩選、強化和重新組合后形成的培養(yǎng)基。 這種培養(yǎng)基在很多方面有天然培養(yǎng)基所無法比擬的優(yōu)點，它既能給細胞提供一個近似于體內(nèi)的生存環(huán)境，又便于控制和提供標準化體外生存環(huán)境。 目前所有的細胞培養(yǎng)都已采用經(jīng)標準化生產(chǎn)、組成和含量都相對固定的各種合成培養(yǎng)基，并已有配制好的干粉型商品。盡管現(xiàn)在的合成培養(yǎng)基成分和含量已經(jīng)較為復雜，但仍然不能完全滿足體外培養(yǎng)細胞生長的需要，合成培養(yǎng)基中還是需要加入一定量的天然培養(yǎng)基予以補充。,合成培養(yǎng)基,常用的合成培養(yǎng)基,目前

17、合成培養(yǎng)基的種類已有數(shù)十種，大多數(shù)培養(yǎng)基都是為適應某種組織細胞的生長而在某種合成培養(yǎng)基的基礎上改良而來的。目前較為常用的有199培養(yǎng)液、 Eagle (MEM、DMEM)培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、HAM培養(yǎng)液等?；A培養(yǎng)基的產(chǎn)品配方成分是公開的，并被業(yè)界普遍采納和使用。例如:MEM、DMEM、1640、199、PRMI1640、IMDM、F12等細胞培養(yǎng)基。,個性化培養(yǎng)基在國外生物制藥企業(yè)被普遍采用。不同的生物制品，不同的細胞株，不同的生產(chǎn)工藝，都需要與之對應的個性化細胞培養(yǎng)基來支持。,個性化細胞培養(yǎng)基被國際生物制藥公司普遍采用,動物細胞培養(yǎng)方法,所謂動物細胞培養(yǎng)是將動物組織或細胞從機體

18、取出，分散成單個細胞，給予必要的生長條件，模擬體內(nèi)生長環(huán)境，使其在體外繼續(xù)生長和繁殖。,微生物細胞和動物細胞性質的比較,微生物和動物細胞培養(yǎng)方法的比較,與微生物細胞培養(yǎng)類似，動物細胞的體外培養(yǎng)有兩種類型：一類是非貼壁依賴性細胞，這類細胞可以采用與微生物培養(yǎng)類似的方法進行懸浮培養(yǎng)；另一類是貼壁依賴性細胞，它們需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面上生長。,第一節(jié) 常用的培養(yǎng)方法,體外培養(yǎng)的動物細胞有兩種類型 一種是非貼壁依賴型細胞，來源于血液、淋巴組織的細胞，許多腫瘤細胞（包括雜交瘤細胞）和某些轉化細胞屬于這一類型，可采用類似微生物培養(yǎng)的方法進行懸浮培養(yǎng)。 另一種是貼壁依賴型細胞，大多數(shù)動物細胞

19、，包括非淋巴組織的細胞和許多異倍體細胞屬于這一類型，他們需要附著于帶適量正電荷的固體或半固體表面上生長。,在貼壁培養(yǎng)過程中，貼壁依賴性細胞需要附著在帶適量正電荷或半固體的表面上，原來是圓形的細胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展開來，然后開始有絲分裂，并很快進入對數(shù)生長期。一般可在數(shù)天后鋪滿生長表面，形成致密的細胞單層。,一、貼壁培養(yǎng),細胞貼壁一般分為：貼壁因子吸附于培養(yǎng)表面、細胞與表面接觸、細胞貼壁于培養(yǎng)表面和貼壁細胞在培養(yǎng)表面上擴展等幾個步驟。,大多數(shù)動物細胞屬于貼壁依賴型細胞,常用的細胞系 Hela：美國婦女宮頸癌細胞 Vero：非洲綠猴腎細胞 BHK：倉鼠腎細胞 CHO：中國倉鼠卵巢細胞,細胞貼壁過程

20、,細胞接觸抑制,接觸抑制(contact inhibition),細胞在貼壁生長過程中，隨著細胞分裂，數(shù)量不斷增加，最后形成一個單層，此時細胞間相互接觸，細胞分裂和生長停止，數(shù)量不再增加。,原代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)：,從供體獲取組織或細胞后的初次培養(yǎng)，一般把第1代細胞的培養(yǎng)與傳10代以內(nèi)的細胞培養(yǎng)統(tǒng)稱為原代培養(yǎng)。,將原代培養(yǎng)的細胞分離稀釋后轉入到新的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。一般是10代以后傳到40、50代。,1、傳代培養(yǎng)的細胞都能一直傳代下去嗎？,2、有些細胞為何能一直傳代下去？,問題,取 的組織、器官,細胞懸浮液,酶,10代細胞,培養(yǎng),培養(yǎng),無限傳代,單個細胞,加 液,動物胚胎 或幼齡動物

21、,胰蛋白,培養(yǎng),原代,傳代,微載體系統(tǒng)的優(yōu)點,1、表面積/體積比大。 2、微載體懸浮于培養(yǎng)基中，細胞生長環(huán)境均一，簡化了這些環(huán)境因素的檢測和控制。用簡單顯微鏡能觀察細胞生長情況。 3、培養(yǎng)基利用率高。 4、采樣重演性好。 5、收獲過程不復雜。 6、放大較容易。 7、勞動強度小，占用空間小。,影響微載體培養(yǎng)的特殊因素,微載體濃度 接種濃度 攪拌轉速,二、懸浮培養(yǎng),所謂懸浮培養(yǎng)，是指細胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依賴型細胞培養(yǎng)，如雜交瘤細胞等。 動物細胞的懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎上發(fā)展起來的。由于動物細胞的特點（如：沒有細胞壁保護，不能耐受劇烈的攪拌和通氣），因此在許多方面又

22、與經(jīng)典的發(fā)酵不同。 懸浮培養(yǎng)的細胞密度較低，轉化細胞懸浮培養(yǎng)有潛在的致癌危險，培養(yǎng)病毒易失去病毒標記而降低免疫能力。,三、固定化培養(yǎng),固定化培養(yǎng)是既適用于貼壁依賴性細胞，又適用于非貼壁依賴性細胞的包埋培養(yǎng)方式，具有細胞生長密度高、抗剪切力和抗污染能力強等優(yōu)點。 由于所培養(yǎng)的細胞的不同，固定化培養(yǎng)的方式也有不同，一般對于貼壁依賴性細胞通常采用膠原包埋，而對于非貼壁依賴性細胞則常用海藻酸鈣包埋。,常用的細胞固定化的方法有 1、吸附：選擇適當?shù)臈l件，將細胞和支持物混合，細胞便貼附在支持物的表面。 2、共價貼附：細胞和支持物通過化學鍵結合，減少了細胞泄露。 3、離子/共價交聯(lián)：如果用聚合物（聚氨等）處

23、理細胞懸液，則會在細胞之間形成橋使之絮結。 4、包埋：此法步驟簡單，條件溫和，細胞和高聚物或單體混合，隨著凝膠的形成，細胞嵌入到高聚物網(wǎng)絡中。 5、微囊化：是在液體狀態(tài)和生理條件下制備的。對細胞的生長條件改變不大。,表 2-1 動物細胞固定化各種方法的特點,第二節(jié) 動物細胞培養(yǎng)的操作方式,動物細胞無論是貼壁培養(yǎng)或是懸浮培養(yǎng)，均可分為分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、灌注式等多種培養(yǎng)方式。,一、分批式培養(yǎng),分批式培養(yǎng)是指先將細胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應器內(nèi)進行培養(yǎng)，細胞不斷生長，同時產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)后，終止培養(yǎng)。,在細胞分批培養(yǎng)過程中，不向培養(yǎng)系統(tǒng)補加營養(yǎng)物質，而只向培養(yǎng)基通入氧

24、，能夠控制的參數(shù)只有PH、溫度和通氣量，因此細胞所處的生長環(huán)境隨著營養(yǎng)物的消耗和產(chǎn)物、副產(chǎn)物的積累時刻都在發(fā)生變化，不能使細胞自始至終處于最優(yōu)的條件下，因而分批培養(yǎng)并不是一種很好的培養(yǎng)方式。分批培養(yǎng)過程的持征如圖所示。,分批式培養(yǎng)的生長曲線,在分批式培養(yǎng)過程中，細胞的生長可分為延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期等五個階段。 為什么說采用分批式培養(yǎng)細胞效果不佳？,分批式培養(yǎng),二、流加式培養(yǎng)（補料分批式）,流加式培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應器，在適宜的條件下接種細胞，進行培養(yǎng)，使細胞不斷生長，產(chǎn)物不斷形成，而在此過程中隨著營養(yǎng)物質的不斷消耗，不斷地向系統(tǒng)中補充新的營養(yǎng)成分，使細胞進一

25、步生長代謝，直到整個培養(yǎng)結束后取出產(chǎn)物。,流加式培養(yǎng)只是向培養(yǎng)系統(tǒng)補加必要的營養(yǎng)成分，以維持營養(yǎng)物質的濃度不變。由于流加式培養(yǎng)能控制更多的環(huán)境參數(shù)，使得細胞生長和產(chǎn)物生成容易維持在優(yōu)化狀態(tài)。,流加式培養(yǎng)有何特點？,流加操作的特點就是能夠調節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)物質的濃度。一方面，它可以避免某種營養(yǎng)成分的初始濃度過高而出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象。另外一個方面，能防止某些限制性營養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被消耗而影響細胞的生長和產(chǎn)物的形成，這是流加式操作與分批式操作的明顯不同。此外，由于新鮮培養(yǎng)液的加入，整個過程中反應體積是變化的，這也是它的一個重要特征。 最常見的流加物質是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物質。,根據(jù)流加控

26、制方式不同，有兩種流加式培養(yǎng)方式：無反饋控制流加和有反饋控制流加。 無反饋控制流加包括定流量加和間斷流加等； 有反饋控制流加一般是連續(xù)或間斷地測定系統(tǒng)中限制性營養(yǎng)物質的濃度，并以此為控制指標來調節(jié)流加速率或流加液中營養(yǎng)物質的濃度等。,流加控制方式,三、半連續(xù)式培養(yǎng),半連續(xù)式培養(yǎng)又可稱為反復分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，是指在分批式培養(yǎng)的基礎上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并重新補充加入等量的新鮮培養(yǎng)基，從而使反應器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變的培養(yǎng)方式。,四、連續(xù)操作,連續(xù)式操作是指將細胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應器內(nèi)進行培養(yǎng)，一方面新鮮的培養(yǎng)液不斷加入反應器內(nèi)，另一方面又將反應液連續(xù)不斷地取出，使反應條件

27、處于一種恒定狀態(tài)。 與分批式操作和半連續(xù)式操作不同。連續(xù)培養(yǎng)可以控制細胞所處的環(huán)境條件長時間的穩(wěn)定，因此，可以使細胞維持在優(yōu)化狀態(tài)下，促進細胞生長和產(chǎn)物形成。,五、灌注式操作培養(yǎng),灌注式操作是指細胞接種后進行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應器，另一方面又將反應液連續(xù)不斷地取出，但細胞留在反應器內(nèi)，使細胞處于一種不斷的營養(yǎng)狀態(tài)。,細胞灌注培養(yǎng)系統(tǒng)實例,動物細胞的連續(xù)培養(yǎng)一般是采用灌注培養(yǎng)。灌注培養(yǎng)是把細胞接種后進行培養(yǎng)，一方面連續(xù)向反應器中注入新鮮的培養(yǎng)基，同時又連續(xù)不斷地取出等量的培養(yǎng)液，但是過程中不取出細胞，細胞仍留在反應器內(nèi)，使細胞處于一種營養(yǎng)不斷的狀態(tài)。當高密度培養(yǎng)動物細胞時，必須確保

28、補充給細胞以足夠的營養(yǎng)以及除去有素毒的代謝物。灌注培養(yǎng)時用新鮮的培養(yǎng)液進行灌注，可以確保上述目的的實現(xiàn)。通過調節(jié)灌注速度，可以把培養(yǎng)過程保持在穩(wěn)定的、廢代謝物低于抑制水平的狀態(tài)下。灌注培養(yǎng)過程的特征如圖所示。,采用灌注培養(yǎng)的優(yōu)越性不僅在于大大提高了細胞生長密度，而且有助于產(chǎn)物的表達和純化。因此，灌注培養(yǎng)已經(jīng)應用于許多不同的培養(yǎng)系統(tǒng)中，規(guī)模已達幾百升。,灌注培養(yǎng)的特點,灌注培養(yǎng)過程的特征,不同培養(yǎng)方式對CHO細胞生產(chǎn)人組織血纖維溶酶原激活劑（tPA)產(chǎn)量和活性的影響,第三節(jié) 細胞培養(yǎng)過程的放大,放大通常是指生產(chǎn)規(guī)模的增大和生產(chǎn)能力的增加。放大的目的是更大規(guī)格重現(xiàn)某個過程并實現(xiàn)預期的實驗結果。,5

29、個不同階段（動物細胞培養(yǎng)由實驗室建立的細胞株到反應器的大規(guī)模培養(yǎng)）,第一階段，篩選和開發(fā)能表達所需產(chǎn)物的細胞系。 第二階段，在方瓶和轉瓶中確定該細胞系對營養(yǎng)物質和環(huán)境的要求。 第三階段，細胞培養(yǎng)轉入生物反應器中進行，最理想的是采用由生產(chǎn)規(guī)模的反應器縮小的臺式反應器。 第四階段，在中試規(guī)模進一步根據(jù)生產(chǎn)的實際條件和可能性，確定過程的控制方案，根據(jù)細胞株的實際情況尋求過程的優(yōu)化方案，對培養(yǎng)的環(huán)境作進一步的調整。 第五階段，擴大到生產(chǎn)規(guī)模。,細胞培養(yǎng)放大過程的5個主要階段,放大過程中的主要影響因素,一、培養(yǎng)基組成 二、限制細胞生長的因素 三、污染的控制 四、產(chǎn)物表達的控制 五、硬件和過程設計參數(shù) 六

30、、產(chǎn)物收獲,一、培養(yǎng)基組成,血清的作用在于向細胞提供激素（生化因子）、轉移蛋白和其他營養(yǎng)物質。目前血清是培養(yǎng)基中不可缺少的組分，并成為達到最優(yōu)化和經(jīng)濟性目標的障礙。降低血清用量和采用無血清培養(yǎng)基成為研究的熱點。,血清培養(yǎng)基的考慮,1、血清中含有廣泛的微量組分，對細胞生長有相當大的作用，但對其存在的作用至今還未充分確定。 2、對通過細胞培養(yǎng)獲得產(chǎn)物的過程，血清的存在是純化的主要障礙，甚至難以使產(chǎn)物形成醫(yī)藥產(chǎn)品。 3、血清常受病毒污染，其中許多對細胞培養(yǎng)無害，但增加了未知因素，未操作者不能控制。 4、血清是培養(yǎng)基成本的主要部分 5、血清不僅有生長促進活力，而且有生長抑制活力。 6、實驗和生產(chǎn)過程的

31、標準化困難。,二、限制細胞生長的因素,在動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中有許多因素限制了細胞生長。與微生物發(fā)酵相比，動物細胞培養(yǎng)能達到的細胞密度比較低。根據(jù)不同的細胞類型、培養(yǎng)系統(tǒng)和培養(yǎng)基組成，其范圍為每毫升（0.5-5）106個細胞。,三、污染的控制,動物細胞培養(yǎng)物可能被各種微生物病毒污染。這些污染物的來源包括細胞種子、血清、試劑、實驗室環(huán)境和操作人員。 在生產(chǎn)過程或實驗室空間中，完全沒有微生物的污染是不可能的，這需要通過改進設備的設計消除這些污染源，其中反應器的設計是關鍵。實驗人員也常是重要的污染源，無菌操作技術的良好訓練是污染控制的基礎。,四、產(chǎn)物表達的控制,動物細胞培養(yǎng)的產(chǎn)物有兩大類。一是細胞本身，

32、另一是由細胞分泌的某些產(chǎn)物。由細胞分泌的產(chǎn)物可以分為3類： 1、天然產(chǎn)物，如淋巴因子、激素、病毒等。 2、基因工程產(chǎn)物，如病毒亞單位蛋白。 3、融合細胞產(chǎn)物，如單克隆抗體。,產(chǎn)物表達的最優(yōu)化條件,細胞生長的最優(yōu)化條件并不一定是產(chǎn)物表達的最優(yōu)化條件。產(chǎn)物常常在細胞的衰退期得到最佳表達，而不是在對數(shù)生長期。目前在穩(wěn)定期或衰退期控制基因表達仍很困難。 產(chǎn)物表達的問題主要是生物學方面的，這些問題的生物學解決辦法有： 1、建立能更高密度生長或對生長條件要求不太嚴格的細胞系。 2、開發(fā)能大量生產(chǎn)目標產(chǎn)品的細胞系。 3、有可能通過誘導分裂或誘導存在質粒的表達使細胞具有高水平的產(chǎn)物表達。 4、開發(fā)更好的克隆載

33、體。,五、硬件和過程設計參數(shù),與大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)有關的反應器和設備問題可歸納為： 1、細胞培養(yǎng)環(huán)境的控制（溫度、溶解氧、二氧化碳、pH值、滲透壓） 2、污染的排除（閥門設計、流體轉移系統(tǒng)、培養(yǎng)基滅菌） 3、抑制潛在的生物病毒物的擴散（反應器的取樣，產(chǎn)物的收獲） 4、為貼壁生長細胞提供足夠的表面積（固體介質的性質、培養(yǎng)系統(tǒng)的比表面積） 5、在培養(yǎng)中對剪切力的控制（攪拌、通氣、細胞收獲）,六、產(chǎn)物收獲,得到大量的細胞所需解決的問題包括： 1、開發(fā)細胞培養(yǎng)方法和工藝，提高細胞密度，使收獲細胞容易。特別是貼壁生長的細胞。 2、凍存好細胞，確保細胞種子的重復性。,與蛋白質收獲有關的問題包括：,1、在生

34、長培養(yǎng)基中存在污染產(chǎn)物的血清蛋白質。 2、由培養(yǎng)細胞表達的細胞產(chǎn)物濃度很低。 3、在培養(yǎng)條件下產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。,解決蛋白質純化的方法包括：,1、使用無血清（甚至無蛋白）培養(yǎng)基使“污染”蛋白量最少。 2、開發(fā)產(chǎn)物特異的親和柱。 3、開發(fā)篩選技術以快速地確定產(chǎn)生大量產(chǎn)物的細胞克隆。 4、開發(fā)在無血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定蛋白質產(chǎn)物以及抑制細胞內(nèi)、外蛋白酶活性的方法。 5、采用中空纖維、微囊或其他合適的技術分離或濃縮產(chǎn)物。 純化的步驟不僅要求效率高，而且盡量不在產(chǎn)物中加入不需要的組分。,第四節(jié) 動物細胞培養(yǎng)生物反應器,生物反應器的設計需滿足的要求,1、生物因素：生物相容性，模擬細胞在體內(nèi)的生長環(huán)境。 2、化學

35、因素：必須提供足夠的停留時間，完成所需要的轉化率，符合過程反應動力學的要求。 3、傳質因素：滿足物質傳遞的要求。 4、傳熱因素：有能力除去和加入反應過程的熱量。 5、安全因素：有毒害的反應物和產(chǎn)物的隔離，有優(yōu)良的防污染性能。 6、操作因素：便于操作和維修。,動物細胞培養(yǎng)生物反應器,自20世紀，70年代以來，用于動物細胞培養(yǎng)的生長反應器有了很大的發(fā)展，種類越來越多，規(guī)模也越來越大。根據(jù)生物反應器的不同用途，有懸浮培養(yǎng)用、貼壁培養(yǎng)用、包埋培養(yǎng)用生物反應器等，其種類大致上有塑料增殖器、填充床增殖器、多層板增殖器、螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶質矩形通道蜂窩狀增殖器、流化床反應器、中空纖維及其他膜式反

36、應器、槳式攪拌反應器、棒式攪拌反應器、船舶推進槳反應器、傾斜槳葉攪拌反應器、般帆形攪拌反應器、往復振動錐孔篩板攪拌反應器、籠式通氣攪拌反應器、雙層籠式通氣攪拌反應器、空氣提升式反應器等。,一、生物反應器的種類,1、懸浮培養(yǎng)用 有空氣提升式（如英國Celltech公司和瑞士Chemap公司）、攪拌槽（如美國NBS公司和德國GBF）、中空纖維管（如美國Bioresponse和Invitron公司）及陶質矩形通道蜂窩狀生物反應器。 2、貼壁培養(yǎng)用 有攪拌槽（微載體系統(tǒng)）、中空纖維管和陶質矩形通道蜂窩狀生物反應器。 3、包埋培養(yǎng)用 有流化床（如美國Bellco公司）、固定床生物反應器。,二、氣升式細胞

37、培養(yǎng)生物反應器,氣升式反應器的基本原理如圖所示。氣體混合物從底部的噴射管進入反應器的中央導流管使得中央導流管側的液體密度低于外部區(qū)域從而形成循環(huán)。氣升式生物反應器主要采用內(nèi)循環(huán)式，但也有采用外循環(huán)式。,氣升式生物反應器,與攪拌式生長反應器相比，氣升式生物反應器產(chǎn)生的湍流溫和而均勻，剪切力相當小，反應器內(nèi)沒有機械運動部件，因而細胞損傷率比較低；同時由于采用直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高；液體循環(huán)量大，能使細胞和營養(yǎng)成分均勻地分布于培養(yǎng)基中。,氣升式生物反應器特點,氣升式反應器和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的抗體產(chǎn)率比較,在氣升式生物反應器中，溶氧的控制可以通過自動調節(jié)進入空氣的速率來實現(xiàn)；PH值可通過在進氣中加

38、入二氧化碳或加入氫氧化鈉來控制。 八種細胞的有關培養(yǎng)數(shù)據(jù)，可以看出同傳統(tǒng)的方法（培養(yǎng)瓶和滾瓶）相比，氣升反應器的抗體產(chǎn)量平均提高4.6倍。,三、中空纖維管生物反應器,中空纖維管生物反應器如下頁圖所示，它的用途較廣，既可培養(yǎng)懸浮生長的細胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細胞，細胞的密度最高可達109/ml數(shù)量級。如果控制系統(tǒng)不受污染，能長期運轉。已用這種反應器培養(yǎng)過的細胞型和生產(chǎn)的分泌產(chǎn)物如表所示（P44，表2-6）。,中空纖維反應器示意圖,中空纖維管生物反應器已進入工業(yè)生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。,中空纖維式生物反應器,平床式中空纖維式生物反應器,四、通氣攪拌生物反應器,CelliGen

39、籠式通氣攪拌器,攪拌式生物反應器,Celligen plus,Celligen 310,Celligen系列生物反應器工作原理,CellGen plus生物反應器,五、無泡攪拌反應器,無泡攪拌反應器是一種裝有膜攪拌器的生物反應器。它采用多孔的疏水性塑料管裝配成通氣攪拌漿，具有良好的氧通透性，同時解決了通氣和均相化的要求。這類反應器能提供動物細胞生長中所需的氧，產(chǎn)生的剪切力較小，在通氣中不產(chǎn)生泡沫，已廣泛應用于實驗室研究和中試、工業(yè)生產(chǎn)。,六、動物細胞反應器的控制,1、溶氧值：可通過改變通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中的氧氣和氮氣的比例。 2、PH的調節(jié)：可采用二氧化碳/碳酸氫鈉緩沖液系統(tǒng)。 3、溫度和攪拌轉

40、速的控制。,其它：流化床生物反應器,流化床生物反應器的基本原理類似于流態(tài)床化學反應器，不同的是，流態(tài)化的固體是帶有細胞的微粒。培養(yǎng)液通過反應器垂直向上循環(huán)流動不斷提供給細胞必要的營養(yǎng)成分，使細胞得以在微粒中生長；同時，不斷地加入新鮮的培養(yǎng)液，并不斷地排除培養(yǎng)產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物。下頁圖為生產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生物反應器的示意圖，這種反應器的傳質性能很好，并在循環(huán)系統(tǒng)中采用膜氣體交換器，能快速提供給高密度細胞所需的氧，同時排除代謝產(chǎn)物；反應器中的液體流速足以使細胞微粒懸浮卻不會損壞脆弱的細胞。由于流化床生物反應器滿足了高密度細胞培養(yǎng)、使高產(chǎn)量細胞長時間停留在反應器中、優(yōu)化細胞生長與產(chǎn)物合成的環(huán)境等細胞培養(yǎng)的要求，流化床生物反應器既可用于貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)，又可用于非貼壁依賴性細胞的培養(yǎng)。,生產(chǎn)用CF-IMMOTM流化床生物反應器示意圖,流化床生物反應器與其它方法培養(yǎng)達到的細胞比較,固定床或流化床式生物反應器,透析袋或膜式生物反應器,動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)