螢光素酶報(bào)告基因技術(shù).ppt

1、Report Smartly螢光素酶報(bào)告基因技術(shù),自然界的螢光,發(fā)光海星發(fā)光甲殼蟲,發(fā)光真菌,發(fā)光節(jié)蟲,自然界的螢光,發(fā)光魚發(fā)光甲蟲,自然界的螢光,螢火蟲,報(bào)告基因的作用,細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子 受體結(jié)合 病毒/細(xì)胞相互作用 轉(zhuǎn)錄因子 藥物誘導(dǎo)作用或”效果,熒光 - Fluorescence 螢光 - Luminescence,Luminescence vs. Fluorescence,各種報(bào)告基因的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn),螢光素酶報(bào)告基因的主要優(yōu)點(diǎn),非放射性 檢測快（比CAT等） 靈敏度高（可比CAT檢測靈敏度高100倍） 半衰期短（在理想條件下，可檢測到10-20 摩爾的螢光素酶分子。在哺乳

2、動(dòng)物細(xì)胞中半衰期3小時(shí)，在植物細(xì)胞中半衰期3.5小時(shí)。而CAT在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的半衰期約50小時(shí)） 線形范圍廣 （在10-16 M(10pg/L)至10-8 M(1mg/L)范圍內(nèi),光強(qiáng)度與螢光素酶濃度成正比） 一般比顯微鏡檢測的熒光更靈敏 (對多孔板而言) 生物螢光比熒光更穩(wěn)定,因?yàn)樽匀唤邕M(jìn)化的酶能保護(hù)光子發(fā)射器 通過基因工程可以延伸生物螢光的性能和能力,螢光素酶報(bào)告基因的使用,原理: 制備含有 luc/ Rluc 的DNA 轉(zhuǎn)染 提供刺激 測量螢光,調(diào)節(jié)序列,Luc,在活細(xì)胞中做報(bào)告基因檢測,外界刺激(導(dǎo)引物,螢光素酶基因,蛋白質(zhì)折疊,調(diào)節(jié)序列,加工,轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄因子,信號轉(zhuǎn)導(dǎo),翻譯,反義

3、RNA,受體,蛋白-蛋白相互作用,RNA 酶,病毒感染和增殖,RNAi 抑制,啟動(dòng)子/增強(qiáng)子分析,碰撞啟動(dòng)子”: 全序列: 2) 逐步缺失,Promoter,luc,Light,Promoter,luc,Light,Promoter,luc,Firefly and Renilla,螢火蟲生物螢光的化學(xué),螢光素,ATP + O2,螢光素酶,Oxyluciferin + AMP,PPi + CO2 + Light,螢光素酶: 單體, 61,000 Daltons,輔-底物: ATP . Mg 2,螢光素,Mg2,海腎螢光素酶反應(yīng),Coelenterazine,O2,螢光素酶,Coelenteram

4、ide,CO2 + Light,螢光素酶: 單體, 36,000 Daltons,螢光素: (Coelenterazine,Enzyme structures,Firefly,Renilla,為什么要使用雙報(bào)告基因,報(bào)告基因 A (首要信號,報(bào)告基因 B (第二信號,特異生物學(xué)反饋 + 非特異生物學(xué)反饋,非特異生物學(xué)反饋,檢測結(jié)果,比較首要與第二信號確定 特異生物學(xué)反饋,細(xì)胞可能有內(nèi)源脫乙?；?-Gal 或 GUS 活性. CAT, -Gal 和 GUS 檢測是終點(diǎn)檢測. 不能同時(shí)對在一個(gè)管中組合了螢光素酶和CAT,或-Gal ,的兩個(gè)報(bào)告基因的檢測都靈敏而快速,傳統(tǒng)的雙報(bào)告基因的缺點(diǎn),雙螢

5、光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)比用CAT和-Gal做內(nèi)對照的優(yōu)點(diǎn),速度 樣品不需預(yù)處理，不需孵育。兩次檢測在幾秒種內(nèi)完成 靈敏 兩個(gè)螢光素酶的線性范圍超過7個(gè)酶濃度數(shù)量級。內(nèi)源螢光素酶背景極低 方便 一管完成檢測，樣品不必分份,實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒,對照質(zhì)粒,用海腎螢光素酶作對照歸一實(shí)驗(yàn)變化,歸一反應(yīng),對照的（海腎螢光素酶,實(shí)驗(yàn)的 (螢火蟲螢光素酶,螢火蟲螢光素酶,海腎螢光素酶,用兩個(gè)螢光素酶做報(bào)告基因 （螢火蟲+海腎,數(shù)據(jù)處理舉例,第一天螢光素酶活性(RLU) 比率 歸一的活性 樣品處理重復(fù)（F:R) 變化倍數(shù) 對照 5,128 2,511 7,553 3,815 10,555 5,413 7,745 3,913

6、1.981.00 處理 5,1376 4,467 40,712 3,574 88,787 7,654 6,0292 5,232 11.525.82 處理B 1 587,635 5,144 988,347 8,832 3 409,881 3,564 661,954 5,847 113.2157.18 第二天 對照 15,529 20,433 0.76 21,897 30,841 0.71 10,760 13,620 0.79 16,062 21,631 0.741.00 處理 850,239 20,843 578,951 14,830 943,873 21,788 791,021 19,154

7、41,3055,81 處理D 1 14,865 19,3-05 8,967 12,284 13,767 20,246 12,533 17,278 0.730.99,活性倍數(shù) (F/R)樣品 = F/R)對照 第二天處理計(jì)算如下： 活性倍數(shù) (791,021/19,154) = （16,062/21,631) = 55.81,GloMax 20/20Single tube luminometer,GloMax 96 luminometer,White microplates for luminescence,Promega公司出品的雙報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)產(chǎn)品,質(zhì)粒 螢火蟲螢光素酶質(zhì)粒 海腎螢光素酶質(zhì)粒

8、叩頭蟲螢光素酶質(zhì)粒 檢測系統(tǒng) 非均質(zhì)雙報(bào)告基因檢測系統(tǒng)（通量較低） 均質(zhì)的雙報(bào)告基因檢測系統(tǒng)（適合高通量，自動(dòng)化,載體 - 螢火蟲螢光素酶載體,pGL3 家族 pGL3-Basic pGL3-Control pGL3-Enhancer pGL3-Promoter,pGL3-Basic Map,pGL3-Control Map,pGL3-Enhancer Map,pGL3-Promoter Map,輔助報(bào)告基因的相對螢光單位 (RLU) 啟動(dòng)子交叉交談或互相干擾 實(shí)驗(yàn)刺激給輔助報(bào)告基因的不必要的調(diào)節(jié),內(nèi)對照載體可能存在的問題,載體 - 海腎螢光素酶報(bào)告基因載體,Renilla 螢光素酶載體系列,

9、內(nèi)含子,T7 啟動(dòng)子,CMV即時(shí)早期增強(qiáng)子/啟動(dòng)子,phRL-CMV,HSV TK 啟動(dòng)子,phRL-TK,SV40 晚poly(A,SV40 早期 增強(qiáng)子/啟動(dòng)子,phRL-SV40,MCS,phRL-null,hRL 基因,TK 啟動(dòng)子,phRL-TK(Int,MCS,phRG-B,合成 poly(A) 信號 轉(zhuǎn)錄停止位點(diǎn),三個(gè)讀碼框的終止密碼子,phRG-TK,合成 poly(A) 信號 轉(zhuǎn)錄停止位點(diǎn),三個(gè)讀碼框的終止密碼子,TK 啟動(dòng)子,hRL 基因,SV40 晚 poly(A,Renilla 螢光素酶載體系列,用螢火蟲和海腎兩個(gè)螢光素酶做報(bào)告基因,Dual-Luciferase 雙螢

10、光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)（非均質(zhì)檢測） E1910，100次 E1960，E1980，1000次 Dual-GloTM 螢光素酶檢測系統(tǒng) （均質(zhì)檢測） E2920，10ml E2940，100ml EE2980，10X100ml,均質(zhì)檢測與非均質(zhì)檢測,發(fā)光,細(xì)胞+培養(yǎng)基,添加試劑,細(xì)胞+培養(yǎng)基,除去培養(yǎng)基,發(fā)光,清洗細(xì)胞,裂解細(xì)胞,添加試劑,均質(zhì)檢測,非均質(zhì)檢測,Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測系統(tǒng)組分,檢測緩沖液II 底物（凍干粉） Stop&Glo緩沖液 Stop&Glo底物,50X 被動(dòng)裂解液,5X,Dual-Luciferase報(bào)告基因檢測步驟,裂解細(xì)胞 被動(dòng)裂解 除去培養(yǎng)基.PB

11、S洗.加1XPLB, 振蕩15分鐘.檢測 主動(dòng)裂解 除去培養(yǎng)基.PBS洗.在1XPLB中刮下細(xì)胞.細(xì)胞轉(zhuǎn)移到試管或小瓶中.1-2次凍融.檢測 檢測,雙螢光素酶檢測方案,1 支試管 2 步檢測 30 秒鐘,Luciferase Assay Reagent II,Passive lysis buffer,Stop&Glo Reagent,DLRTM For HTS,DLR雙報(bào)告基因檢測系統(tǒng)應(yīng)用舉例,黑色素刺激激素(-MSH)對由人酪氨酸酶啟動(dòng)子增強(qiáng)子控制的螢光素酶的表達(dá)的誘導(dǎo)(Promega eNotes) 目的：監(jiān)測細(xì)胞對-MSH誘導(dǎo)的應(yīng)答 材料： 實(shí)驗(yàn)載體：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶啟

12、動(dòng)子增強(qiáng)子Luc(+) 陽性對照：pGL3-Control 陰性對照：pGL3-Basic 內(nèi)對照：pRL-SV40 B16-F1細(xì)胞（鼠黑素瘤細(xì)胞系CRL-6323) DLR 雙螢光素酶檢測試劑盒,步驟 前一天：接種細(xì)胞，六孔板X3 第二天：共轉(zhuǎn)染：pGL3-Try14A和pRL-SV40（分成兩組） pGL3-Control和 pRL-SV40 pGL3-Basic和 pRL-SV40 裂解細(xì)胞，測量螢光,Dual-Glo螢光素酶檢測系統(tǒng),檢測特點(diǎn) 均質(zhì)檢測，為高通量檢測而設(shè)計(jì) 螢光信號穩(wěn)定，2hrs內(nèi)檢測 自發(fā)螢光低于檢測水平,Dual-Glo Assay: 同一樣品中檢測兩種螢光信號,

13、Stable luminescence signals for both reporters (t1/2 3.5 hrs.) 10,000-fold signal separation between the firefly and Renilla bioluminescence,Primary reporter: Firefly bioluminescence,Secondary reporter: Renilla bioluminescence,Cells in culture medium,Add fireflyassay reagent,Add combination firefly

14、quench reagent& Renilla assay reagent,Dual-Glo assay-選擇性淬滅螢火蟲螢光,Selective quench of firefly luminescence,Dual-Glo螢光素酶檢測系統(tǒng),試劑盒組成 Dual-Glo螢光素酶緩沖液 Dual-Glo螢光素酶底物（凍干粉） Dual-GloStop-Glo緩沖液 Dual-GloStop-Glo底物,操作步驟,試劑制備簡單 將Dual-Glo 螢光素酶緩沖液倒入 Dual-Glo 螢光素酶底物中 用Dual-Glo Stop &Glo 緩沖液按1:100 稀釋 Dual-Glo Stop &

15、Glo 底物 所有的緩沖液存于室溫, 所有的底物存于 20C 兩步加入試劑: 加, 讀, 加, 讀 10,000 倍信號分離 (淬滅,用兩個(gè)螢光素酶做報(bào)告基因Chroma-LucTM載體Chroma-Glo檢測試劑,E.Coli 表達(dá)的Chroma-LucTM 基因,Chroma-LucTM 基因和載體,三個(gè)基因: 1. CBRluc 發(fā)紅光的螢光素酶 2. CBG99luc 發(fā)綠光的螢光素酶 99.0% DNA 相同于 CBRluc 3. CBG68luc -發(fā)綠光的螢光素酶 68.9% DNA相同于 CBRluc 兩種載體骨架: 1. 對照 置換了 pGL3-Control 的luc+ (

16、pCBR-Control, pCBG68-Control, and pCBG99-Control) 2. Basic 置換了 pGL3-Basic 的luc+ (pCBR-Basic, pCBG68-Basic, and pCBG99-Basic,合成的 Chroma-LucTM 螢光素酶載體骨架,Control Basic Enhancer,SV40 啟動(dòng)子,SV40 增強(qiáng)子,SV40 增強(qiáng)子,合成的或天然的基因,Chroma-Glo 檢測的化學(xué),Luciferin,ATP + O2,Luciferase,Oxyluciferin + AMP,PPi + CO2 + Light,Lucife

17、rase: Monomeric, 61,000 Daltons,Co-substrates: ATP . Mg 2,Luciferin,不同顏色，同樣試劑,C2,C2,旋轉(zhuǎn)，較少能量，紅光,不旋轉(zhuǎn)，較多能量, 黃綠光,Chroma-LucTM 螢光素酶濾光片選擇,510/60nm,610nm Long pass,Chroma-Glo 檢測的特點(diǎn),為高通量檢測設(shè)計(jì)，檢測96-、384-孔板 均質(zhì)檢測 需要帶濾光片的螢光發(fā)光計(jì),pGL4: A New Family of Reporter Vectors,Next generation reporter vectors (pGL4,Improved

18、 Reporter Performance,Improved Expression of luc2,Provides 5 -10 x higher expression than luc+ in mammalian cells,Large reduction of consensus sites where inappropriate interactions with host may occur,Sites removed from vector, reporter genes, and selectable markers: Restriction sites Vertebrate TF

19、 binding sites Promoter modules Eukaryotic splice acceptor and donor sites Eukaryotic poly A sites Kozak sequences,Reduction in Consensus Binding Sites,Increased Response Using Rapid Response Luciferases,Compared to regular luciferase, Rapid Response luciferases gave higher induction in shorter time

20、,Induction at 3h,192,79,150,為什么需要快速反應(yīng)螢光素酶基因？（現(xiàn)存報(bào)告基因的缺點(diǎn)） 研究者想要報(bào)告基因應(yīng)答與細(xì)胞事件在時(shí)間上更快地耦聯(lián) 需要更強(qiáng)的應(yīng)答 較長的敷育時(shí)間可能導(dǎo)致檢測到次級效應(yīng)(假陽性,Rapid ResponseTM 報(bào)告基因技術(shù)(不穩(wěn)定的螢光素酶基因,細(xì)胞內(nèi)報(bào)告 基因池,信號,新表達(dá)的 報(bào)告基因,為什么快速應(yīng)答的報(bào)告基因應(yīng)答性更強(qiáng),快速應(yīng)答,非-快速應(yīng)答,新表達(dá)的 報(bào)告基因,信號,基于報(bào)告基因穩(wěn)定性的動(dòng)力學(xué)模型,pGL4 Rapid Response Reporters Gene Design,VectorGeneDesign pGL4.10 luc

21、2luc2 pGL4.11 luc2Pluc2P pGL4.12 luc2CPluc2CP pGL4.70 hRluchRluc pGL4.71 hRlucPhRlucP pGL4.72 hRlucCPhRlucCP,快速應(yīng)答報(bào)告基因的設(shè)計(jì),蛋白降解序列 來自PEST鼠鳥氨酸脫羧酶的序列 (40 aa) 來自酵母CL1 序列 (18 aa) RNA 降解序列 根據(jù)saimiri皰疹病毒小核 RNA合成的富 AU 因子 (ARE) 螢光素酶基因 為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)優(yōu)化了密碼子 優(yōu)化了翻譯起始序列 (如, Kozak 序列) 缺失了多數(shù)已知的轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)合位點(diǎn)序列,New Multiple Cloning Region,pGL4 載體系列的優(yōu)勢,更亮的螢光 Codon optimized for m