重組載體質(zhì)粒擴(kuò)增流程

1、.重組載體質(zhì)粒擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)步驟：、感受態(tài)細(xì)菌的制備（CaCl2化學(xué)轉(zhuǎn)化法） 準(zhǔn)備：LB液體培養(yǎng)基、LB固體平板（含抗生素和未含抗生素）、0.1mol/L氯化鈣溶液（預(yù)冷）、細(xì)菌凍存液（0.1Mol/L CaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油）、高壓過的EP管等1、將適合的凍存菌（ stbl3）挑取一點(diǎn)（槍頭沾取一點(diǎn)）加入盛有1ml LB液體培養(yǎng)基的15ml離心管中；37，220rpm，搖菌培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)（復(fù)蘇)。2、取10l以下剛復(fù)蘇的stbl3涂布于非抗性的LB固體培養(yǎng)基上37過夜培養(yǎng)（純化）。3、挑取20多個(gè)前一天培養(yǎng)的細(xì)菌菌落加入3ml LB液體培養(yǎng)基里37，220rpm，搖菌培養(yǎng)

2、12個(gè)小時(shí)（擴(kuò)增，需使細(xì)菌老化，因?yàn)橄乱徊綋u出的菌才可處于對(duì)數(shù)生長期）。4、以1：100的比例將3ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于300ml LB培養(yǎng)基中，在37 220rpm搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約1.5-2小時(shí)（使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期，易于轉(zhuǎn)化，可每半小時(shí)測一下OD600值，使其0.3-0.5）；5、制冰。 以下步驟開始注意無菌操作：6將所有培養(yǎng)好的菌液分裝移至離心管中，在冰上冷卻10分鐘； 74下3000g冷凍離心10分鐘； 8棄去上清，加入 30ml預(yù)冷0.1Mol/L CaCl2 溶液，輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘； 94下3000g冷凍離心10分鐘； 10 棄去上清，加入 5ml預(yù)

3、冷0.1Mol/L CaCl2 溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)菌重新懸?。?1 4下3000g冷凍離心10分鐘；12. 棄去上清，加6ml 0.1Mol/L CaCl2+7%/10%的DMSO或15%的甘油混勻后，分裝成100l或200ul/EP管（4預(yù)冷），-80冷凍貯存?zhèn)溆?。【練手?shí)驗(yàn)中擴(kuò)增搖菌時(shí)中途搖床關(guān)閉了一段時(shí)間（具體不詳），后續(xù)接著搖菌過夜。離心時(shí)用的6000rpm，第二次離心時(shí)很快溶解，遂進(jìn)行了第三次離心獲取沉淀。配制凍存液忽視了甘油對(duì)氯化鈣的稀釋，用1.8ml 50%的甘油加入4.2ml 0.1mol/L的氯化鈣，即氯化鈣的濃度沒有達(dá)到0.1mol/L 。分裝時(shí)每個(gè)EP管

4、含有300l的感受態(tài)細(xì)菌?！?、重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌及轉(zhuǎn)化成功細(xì)菌（即轉(zhuǎn)化子）的篩選 準(zhǔn)備：含篩選抗生素的固體培養(yǎng)基、冰、42水浴鍋、37預(yù)熱的培養(yǎng)基1、 取100l感受態(tài)細(xì)菌在冰上解凍，每管加質(zhì)粒載體（體積10l，DNA50ng），輕彈以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min。2、 將EP管放到預(yù)加溫到42的循環(huán)水浴中的浮板上，放置90s2min，不要搖動(dòng)EP管。3、 快速將EP管轉(zhuǎn)移到冰浴上中，使細(xì)菌冷卻12min 4、 每離心管加400l LB培養(yǎng)基，事先用水浴將培養(yǎng)基加溫到37，然后將管轉(zhuǎn)移到37搖床上，溫育45min至1H使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。5、 將適當(dāng)體積（1

5、0l?）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)菌涂布到含相應(yīng)抗生素抗性（100g/ml的終濃度）的LB固體培養(yǎng)基上旋轉(zhuǎn)均勻涂布直至有發(fā)澀的感覺，即使平板干燥，然后倒置平皿，于37培養(yǎng)，1216h后可出現(xiàn)菌落（或者將質(zhì)粒涂布均勻后在37孵箱里先正放培養(yǎng)30min左右，再倒放培養(yǎng)）?！揪毷謱?shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化VSVG質(zhì)粒的平板長了2個(gè)菌落，而8.2質(zhì)粒的平板貌似沒有菌落形成。分析原因排除了平板氨芐青霉素濃度（100g/ml）太高,可能有兩個(gè)原因：1、復(fù)蘇的細(xì)菌濃度低，操作時(shí)將100l感受態(tài)細(xì)菌加入了800l的培養(yǎng)基搖菌，并且只搖菌40min；2、涂板時(shí)量太少，只加了20l的復(fù)蘇菌涂布?？偟膩碚f可能種在平板上的細(xì)菌太少?！俊⑥D(zhuǎn)化細(xì)

6、菌的擴(kuò)增：準(zhǔn)備：LB培養(yǎng)基1、 挑取以上培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化細(xì)菌的單菌落（1至數(shù)個(gè)）于2.5ml 有氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基里37 220rpm搖菌12H（擴(kuò)增細(xì)菌）2、 將上一步搖的2.5ml細(xì)菌加入250ml抗性LB液體培養(yǎng)基（氨芐青霉素）里，37 220rpm搖菌24H（擴(kuò)增質(zhì)粒）注：擴(kuò)增的質(zhì)粒不能立即提取時(shí)可將所有菌液轉(zhuǎn)移至離心瓶里6000rpm離心收集細(xì)菌沉淀，然后-20保存?！敬舜翁豳|(zhì)粒的細(xì)菌連同LB培養(yǎng)基一起凍存了，應(yīng)把離心棄去培養(yǎng)基后僅凍存沉淀】、重組載體質(zhì)粒提取及純化（詳見試劑盒質(zhì)粒提取步驟）1 用15 ml離心管收集1-5 ml菌液。12,000 rpm離心1min，棄上清。 根據(jù)

7、所培養(yǎng)菌體的濃度與質(zhì)粒的拷貝數(shù)，確定收集的菌液量。2 加入250 l溶液/RNase A混合液，漩渦劇烈振蕩直至菌體完全重新懸浮。室溫靜置1- 2min。3 加入250 l溶液，輕柔地反復(fù)顛倒混勻5-6次。室溫放置1-2 min，使菌體充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。 不可劇烈混和，否則會(huì)使染色體DNA 斷裂。 此步驟不宜超過5 min。4 加入350 l溶液，立即輕柔地反復(fù)顛倒混勻5-6次。此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。5 12,000 rpm 室溫離心10 min，收集上清。6 將上清置于DNA純化柱中，靜置1-2 min。 如果收集的上清液過多，超過DNA 純化柱容積（800 l），可將上清

8、分次加入DNA 純化柱中。7 12,000 rpm 離心1 min，棄濾液。 此時(shí)質(zhì)粒DNA 被吸附于DNA 純化柱的硅膠膜上。8 加入500 l 溶液PB，12,000 rpm 離心1 min，棄濾液。 此步驟的作用是將硅膠膜上吸附的蛋白、鹽等雜質(zhì)洗脫，以獲得高質(zhì)量質(zhì)粒DNA。9 加入500 l溶液W，12,000 rpm 離心1 min，棄濾液。 溶液W 初次使用前用無水乙醇按1: 1.5 稀釋，即含60%乙醇。10 加入500 l溶液W，12,000 rpm 離心1 min，棄濾液。11 12,000 rpm 離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。12 將DNA純化柱置于新的離心管

9、中。向純化柱中央處，懸空滴加50-100 l 溶液Eluent，室溫放置2 min。 12,000 rpm離心1 min， 管底即為高純度質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA 于-20保存 溶液 Eluent 可用無菌雙蒸水代替，但其pH 需為8.0-8.5。溶液Eluent 的加入體積視質(zhì)?？截悢?shù)多少、依質(zhì)粒濃度要求而定。、重組載體質(zhì)粒的濃度及純度測定（紫外分光光度法）： 測OD260、OD280（先將DNA50倍稀釋即2lDNA加入98l溶液Eluent 中，然后加入比色皿檢測）質(zhì)粒濃度=50OD260n （50為每OD260值代表50g/ml的雙鏈DNA；OD260為260nm的吸光光度值；n為稀釋倍

10、數(shù)）質(zhì)粒純度=OD260/OD280（比值在1.8-2.0比較純）【此次提的質(zhì)粒稀釋50倍后OD260為0.121、OD280為0.123；所以濃度為302.5ng/ul；質(zhì)粒純度OD260/OD280為0.983，考慮蛋白參入太多】、重組載體質(zhì)粒的鑒定：方法1：雙酶切電泳(插入片段在2Kb以上時(shí))；直接DNA電泳可判斷整個(gè)重組載體質(zhì)粒是否正確。方法2：PCR（插入片段在2Kb以下時(shí)）電泳方法3：送公司測序附：LB培養(yǎng)基將下列組分溶解在0.9L水中：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化鈉10g再補(bǔ)足水至1L。注：瓊脂平板需添加瓊脂粉12g/L,上層瓊脂平板添加瓊脂粉7g/L。氨芐青霉素（ampici

11、llin）（100mg/ml）溶解1g氨芐青霉素鈉鹽于足量的水中，最后定容至10ml，濃度為100mg/ml。分裝成小份于-20貯存。常以25ug/ml50ug/ml（還是100g？）的終濃度添加于生長培養(yǎng)基。重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌方法2：電轉(zhuǎn)化、電感受態(tài)細(xì)胞的制備第一天： 1. 將適合的凍存菌（ DH5）挑取一點(diǎn)加入盛有1ml LB液體培養(yǎng)基的15ml離心管中；37，220rpm，搖菌培養(yǎng)1個(gè)小時(shí)（復(fù)蘇）。2、取10l以下剛復(fù)蘇的DH5涂布于非抗性的LB固體培養(yǎng)基上37過夜培養(yǎng)。3. 高溫滅菌大的離心瓶（250-500ml）以備第二天搖瓶用 4. 準(zhǔn)備幾瓶滅菌水（總量約1.5升），保存于冷凍室

12、中以備第二天重懸浮細(xì)胞用 第二天： 5、挑取單個(gè)前一天培養(yǎng)的細(xì)菌菌落加入3ml LB液體培養(yǎng)基里37，220rpm，搖菌培養(yǎng)12個(gè)小時(shí)。6. 以1：100的比例取1ml菌液加入盛有100ml LB液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中37C，220rpm，振搖2-3小時(shí)，定時(shí)監(jiān)控OD.600值（培養(yǎng)1小時(shí)后每半小時(shí)測定一次）7. 當(dāng)O.D.600值達(dá)到0.3-0.4時(shí)，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻15min至30min8.將100ml培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心瓶中，4C 2500rpm下離心10min，棄上清液。9. 加入幾毫升滅菌冰水用渦旋儀或吸液管重懸浮細(xì)胞，然后加水至離心管的2/3體積稀釋。 10. 40

13、00rpm離心10分鐘（還是2500rpm 10min？），小心棄去上清液 11. 同步驟9用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞 12. 4000rpm離心10分鐘，棄上清液 13. 用20ml滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細(xì)胞 14. 4000rpm離心10分鐘，小心棄去上清液（甘油稀釋的細(xì)菌離心后沉淀更松散，需小心棄液） 15. 用10%甘油重懸浮細(xì)胞至最終體積為2-3ml 16. 將細(xì)胞按100l或200ul/管等份裝入微量離心管，于-80C保存。 【可同時(shí)取100l感受態(tài)細(xì)菌加0.01ng puc18直接電穿孔轉(zhuǎn)化，檢測轉(zhuǎn)化效率。次日觀察轉(zhuǎn)化子生長情況】、細(xì)胞轉(zhuǎn)化1、事先用無水乙醇清洗浸泡在無水乙醇中的電擊杯，于超凈臺(tái)吹干，將載體質(zhì)粒（名稱？）、800ul無抗生素LB和0.1CM的電擊杯一起置于冰上預(yù)冷。2. 在冰上解凍一管100l的電感受態(tài)細(xì)胞，添加1-10l載體質(zhì)粒（體積？） ，冰上培育約5分鐘。 3. 轉(zhuǎn)移DNA/細(xì)胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器（無泡）中，混勻后轉(zhuǎn)入電擊杯中.輕輕敲擊電極杯使混合物均勻進(jìn)入電極杯的底部.4. 加載P1000（移液器），準(zhǔn)備好800