三七不同藥用部位有效成分含量測定

1、三七不同藥用部位有效成分含量測定崔翰明 林海 路文龍 程慧平 張春光 王階*中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院（北京市宣武區(qū)北線閣5號，100053）摘要：目的 建立三七不同藥用部位中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re和Rb1的HPLC含量測定方法，比較三七不同藥用部位中上述4種皂苷的含量。方法 三七不同藥用部位（主根、筋條、剪口、葉、花）甲醇提取，RP-HPLC/UV法測定，Kromasil C18（2504.6mm，5m）色譜柱；以不同比例乙腈和水（v/v）線性梯度洗脫；流速：1mLmin-1；柱溫：30；檢測波長：203nm；進(jìn)樣量：10L。結(jié)果 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re和Rb1可達(dá)到基

2、線分離，其中人參皂苷Rg1和Re的分離度大于1.5；三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re和Rb1的線性范圍分別為：4.4-440gmL-1，4.32-1080gmL-1， 4.24-212gmL-1和4.48-1120gmL-1；4種皂苷的精密度和日間差RSD（n5）分別為0.46，0.24，0.77，0.68和1.64，0.69，0.52，0.65；加樣回收率分別為103.261.22，103.180.49，103.201.58，103.860.39；三七不同藥用部位含上述4種皂苷總量的順序?yàn)榧艨谥鞲顥l葉花；而三七主根含上述4種皂苷總量的順序?yàn)?0頭80頭40頭20頭100頭。結(jié)論 本方法簡

3、便、靈敏、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，可用于準(zhǔn)確分析三七不同藥用部位中上述4種皂苷的含量。關(guān)鍵詞：三七；三七皂苷；高效液相色譜；含量測定Abstract: Objective: A quantitative method was developed by gradient elution for the determination of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re and ginsenoside Rb1 in different position of Radix Notoginseng by HPLC. The content

4、 of 4 kinds saponins in different position of Radix Notoginseng was compared. Method: The different position of Radix Notoginseng (including root, rhizome, branch root, leaf, flower) were extracted with methanol. The HPLC conditions include Kromasil C18column (2504.6mm，5m), different proportion acet

5、onitrile and water linearity gradient elution, flow rate at 1.0mLmin-1, column temperature at 30, wavelength 203nm. Result: The linear ranges of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Re and ginsenoside Rb1 were 4.4-440gmL-1, 4.32-1080gmL-1, 4.24-212gmL-1 and 4.48-1120gmL-1, respectively.

6、4種皂苷的精密度和日間差RSD（n5）分別為0.46，0.24，0.77，0.68和1.64，0.69，0.52，0.65；加樣回收率分別為103.261.22，103.180.49，103.201.58，103.860.39；三七不同藥用部位含上述4種皂苷總量的順序?yàn)榧艨谥鞲顥l葉花；而三七主根含上述4種皂苷總量的順序?yàn)?0頭60頭20頭40頭100頭。結(jié)論 本方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，可用于準(zhǔn)確分析三七不同藥用部位中上述4種皂苷的含量。Conclusion: The method was simple, sensitive, accurate and repeat, and was

7、 suitable in determination of the content of 4 kinds saponins in different position of Radix Notoginseng.method was sampa To structure.三七為五加科Araliaceae人參屬Panax植物三七Panax notoginsng (Burk) F.H.Chen。主產(chǎn)于我國云南、廣西等省，為我國特產(chǎn)的傳統(tǒng)珍貴藥材。三七的主要有效成分為三七皂苷，其中含量較高的有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和Rf等14。目前，市場上商品三七的規(guī)格品種多樣，質(zhì)量不一。0

8、5版藥典規(guī)定三七為其原植物的根和根莖，其中主根為臨床所用三七，支根習(xí)稱筋條，根莖習(xí)稱剪口。三七總皂苷提取物生產(chǎn)廠家常用三七剪口或筋條為原料，民間也有使用三七葉和花。而不同的三七藥用部位其主要皂苷類成分的含量差別較大。因此，建立一種測定三七不同藥用部位中主要皂苷類成分（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re和Rb1）含量的方法，并比較不同藥用部位和不同規(guī)格三七中上述4種皂苷的含量具有重要意義。1. 儀器與試藥德國Knaver二元高壓泵、Knaver UV Detecter；Kromasil C18色譜柱（2504.6mm，5m，100）。三七主根（20-100頭）、筋條（側(cè)根）、剪口（根莖）、葉、花

9、均購自云南文山；三七對照藥材、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re和Rb1對照品均購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈（Fisher制劑公司），高純水（Milliq超純水機(jī)）。2. 方法與結(jié)果2.1 色譜條件色譜柱：Kromasil C18色譜柱（2504.6mm，5m，100）；流動相：乙腈（A）水（B）線性梯度洗脫（v/v），比例見表1；流速：1mLmin-1；柱溫：30；檢測波長：203nm。進(jìn)樣量：10L。表1：乙腈（A）水（B）流動相梯度表（v/v）時(shí)間0min13min30min35min40min乙腈（A）20%20%25%40%20%水（B）80%80%75%60%80%2.2

10、 供試品溶液的制備參考藥典方法5，分別取三七主根（20、40、60、80、100頭）、三七筋條（側(cè)根）、三七剪口（根莖）、三七葉、三七花粉末（過四號篩）0.6g，精密稱定，分別精密加入甲醇50mL，稱定重量，放置12小時(shí)，置于80水浴中保持微沸2h，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，0.45m濾芯過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。分別取上述不同供試品溶液10L進(jìn)樣，按照2.1色譜條件測定，記錄色譜圖。其結(jié)果見圖1。AB圖1. 三七HPLC圖譜。A.混合對照品色譜圖；B. 三七主根色譜圖（圖中1為三七皂苷R1、2為人參皂苷Rg1、3為人參皂苷Re、4為人參皂苷Rb1）。由上圖可見各峰可達(dá)到基線

11、分離，其中難分離的人參皂苷Rg1和Re的分離度為1.75，大于05版藥典定量要求的1.5。2.3 線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線分別精密稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re和Rb1對照品適量，用甲醇將其配制成一定濃度的溶液，分別精密量取一定量，用甲醇稀釋成適宜濃度的系列溶液，即得對照品溶液。分別取上述對照品溶液10L進(jìn)樣，按2.1色譜條件測定，記錄色譜圖。以對照品濃度C（gmL-1）和色譜峰面積A作線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中三七皂苷R1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A2.5159C-0.9402，R20.9999，線性范圍為4.4-440gmL-1；人參皂苷Rg1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A2.914C-2.5983，R21，線

12、性范圍為4.32-1080gmL-1；人參皂苷Re的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A2.8113C+1.9988，R20.9999，線性范圍為4.24-212gmL-1；人參皂苷Rb1的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A2.347C-0.4003，R20.9999，線性范圍為4.48-1120gmL-1。2.4 最低檢測限和定量限考察將對照品溶液進(jìn)行稀釋，以信噪比（S/N）3，確定其最低檢測限，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1的最低檢測限分別為：1.32，1.29，1.27，0.67gmL-1。以信噪比（S/N）10，確定其最低定量限，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1的最低定量限分別為：4.4，4.32，4

13、.24，2.24gmL-1。2.5 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)取濃度為110gmL-1的三七皂苷R1，540gmL-1人參皂苷Rg1，560gmL-1人參皂苷Rb1，42.4gmL-1人參皂苷Re對照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣10L，按2.1色譜條件重復(fù)測定5次，記錄色譜圖。根據(jù)峰面積按各自的線性方程計(jì)算濃度，以計(jì)算濃度與配制濃度之比為回收率和精密度，并求RSD。結(jié)果見表2。表2. 測定方法的精密度和回收率（n=5）樣品三七皂苷R1人參皂苷Rg1人參皂苷Re人參皂苷Rb1配制濃度110gmL-1540gmL-142.4gmL-1560gmL-1計(jì)算濃度110.180.51540.031.3041.900.3

14、2563.473.83回收率（）100.160.46100.000.2498.810.76100.620.68精密度（RSD）0.460.240.770.68取濃度為110gmL-1的三七皂苷R1，540gmL-1人參皂苷Rg1，560gmL-1人參皂苷Rb1，42.4gmL-1人參皂苷Re對照品溶液，分別在放置0、1、2、5、7d后按照2.1色譜條件測定，記錄色譜圖。根據(jù)峰面積按各自的線性方程計(jì)算濃度，以計(jì)算濃度與配制濃度之比為回收率和精密度，并求日間差。結(jié)果見表3。表3. 測定方法的日間差（n=5）樣品三七皂苷R1人參皂苷Rg1人參皂苷Re人參皂苷Rb1配制濃度110gmL-1540gmL

15、-142.4gmL-1560gmL-1計(jì)算濃度108.271.77534.763.6842.080.22559.123.66回收率（）98.421.6199.030.6899.250.5299.840.65日間差（RSD）1.640.690.520.652.6 加樣回收率試驗(yàn)取已知濃度的三七供試液1mL，分別精密加入濃度為110gmL-1的三七皂苷R1、216gmL-1人參皂苷Rg1、112gmL-1人參皂苷Rb1和42.4gmL-1人參皂苷Re對照品溶液1mL，用甲醇定容至5mL。按2.1色譜條件重復(fù)測定5次，記錄色譜圖。根據(jù)峰面積按各自的線性方程計(jì)算濃度，以計(jì)算濃度與配制濃度之比為回收率和

16、精密度，并求RSD。結(jié)果見表4。表4. 加樣回收率（n=5）樣品三七皂苷R1人參皂苷Rg1人參皂苷Re人參皂苷Rb1供試液含量270.14g462.10g175.62g534.78g加樣量110g216g42.4g112g配制濃度76.03gmL-1283.05gmL-143.60gmL-1310.34gmL-1計(jì)算濃度78.500.93292.051.3845.000.69322.321.21回收率（）103.261.22103.180.49103.201.58103.860.39RSD1.180.471.530.382.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)精密稱取三七主根（20頭）0.6g，按2.2供試品溶液的

17、制備方法制備6份樣品，分別取10L進(jìn)樣，按照2.1色譜條件測定，記錄色譜圖。根據(jù)峰面積按各自的線性方程分別計(jì)算三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量，并求6次測定的RSD。結(jié)果見表5。表5. 重現(xiàn)性（n=6）取樣量（g）三七皂苷R1含量（mg/g）人參皂苷Rg1含量（mg/g）人參皂苷Re含量（mg/g）人參皂苷Rb1含量（mg/g）0.60627.4934.983.8449.380.60857.3834.473.9149.660.60497.4234.563.9349.640.60607.3934.393.8249.020.60687.3634.183.8548.8

18、60.63607.5034.763.9750.76meanSD7.420.00434.550.083.890.00349.550.45RSD0.050.230.090.922.8 不同藥用部位和不同規(guī)格三七的測定分別取不同藥用部位和不同規(guī)格三七供試品溶液10L進(jìn)樣，按照2.1色譜條件測定，記錄色譜圖。根據(jù)峰面積按各自的線性方程計(jì)算三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1和Re的含量，結(jié)果見表6和圖3。表6. 不同藥用部位和不同規(guī)格三七中4種皂苷含量樣品三七皂苷R1含量（mg/g）人參皂苷Rg1含量（mg/g）人參皂苷Re含量（mg/g）人參皂苷Rb1含量（mg/g）4種皂苷總量（mg/g）20頭三

19、七7.5234.763.9750.7697.0240頭三七8.1335.745.1041.3790.3460頭三七8.7243.112.4261.20115.4580頭三七19.1746.246.3748.74120.52100頭三七7.6132.333.3346.7990.06三七筋條10.8033.153.3838.2685.60三七剪口19.3546.578.3755.52129.82三七葉0.170.800.076.787.82三七花1.700.170.0218.2620.15圖2. 不同藥用部位和不同規(guī)格三七中4種皂苷的含量由表6和圖3可見，三七不同藥用部位含上述4種皂苷總量的順序?yàn)榧艨谥鞲顥l花葉；而三七主根含上述四種皂苷總量的順序?yàn)?0頭60頭20頭40頭100頭。3 討論按照2005版中國藥典三七項(xiàng)下的色譜條件無法分離人參皂苷Rg1和Re，而人參和西洋參項(xiàng)下的色譜條件雖然可以將Rg1和Re分離，但所需分析時(shí)間均達(dá)到100min。我們在藥典三七項(xiàng)下的色譜條件基礎(chǔ)上，以人參皂苷Rg1和Re分離度為目標(biāo)，經(jīng)系統(tǒng)優(yōu)化后將HPLC方法定為2.1的色譜條件。此方法能很好的分離三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re和Rb1，其中難分離的人參皂苷Rg1和Re可達(dá)到基線分離，其分離度達(dá)到1.75。經(jīng)方法學(xué)