HIS鎳柱純化方法

1、純化前準備1. 推薦在中性至弱堿性條件下（pH 7-8）結合重組蛋白。磷酸鹽buffer是常用的緩沖液，Tric-Cl在一般情況下可用，但要注意它會降低結合強度。2. 避免在buffer中包含EDTA或檸檬酸鹽等螯合劑。3. 若重組蛋白以包涵體形式表達，在所有的buffer中添加6 M鹽酸胍或8 M尿素4. 避免緩沖液中有高濃度的電子供體基團，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等等5. 各種緩沖液里不能有高濃度的強還原劑，比如DTT，防止二價Ni被還原；6. 不能含離子型的去垢劑，比如SDS，防止Ni流失；7. 緩沖液里可以加入甘油，防止蛋白之間由于疏水相互作用而發(fā)生聚集沉淀，甘油濃度最

2、高可達50%（v/v）8. 緩沖液里NaCl的濃度應在300mM到2M之間；9. 可加入非離子型去垢劑，如Triton，Tween，NP40等，最高2%，可以減少背景蛋白污染和去除核酸污染注：1. 包含尿素的樣品可直接進行SDS-PAGE分析，若樣品中包含鹽酸胍，在SDS-PAGE前則需先用含有尿素的buffer進行透析2. 除利用咪唑洗脫蛋白，其它方法，如低pH值法等可被應用，詳見說明書Binding buffer 中咪唑的濃度在洗滌時所用的Binding buffer 中咪唑濃度越大，重組蛋白純度越高。但過高的咪唑濃度將導致蛋白的洗脫。合適的咪唑濃度需要優(yōu)化。Buffer 的準備所用的水及

3、化學物質須是高純度的。Buffer 在使用前需經(jīng)0.45m濾膜過濾。所用高純度的咪唑需在280nm 處無吸光度或吸光度極低。推薦 buffer （使用前用0.45 m filter過濾）Binding buffer：20 mM 磷酸鹽 0.5 M NaCl 20- 40 mM 咪唑 pH 7.4 （咪唑濃度是蛋白依賴的，可變?。〦lution buffer ：20 mM 磷酸鹽 0.5 M NaCl 500 mM 咪唑 pH 7.4 （咪唑濃度是蛋白依賴的，可變?。?. 樣品準備 樣品需被充分溶解。過柱前經(jīng)0.45 m濾膜過濾。樣品以pH 7.4 binding buffer 溶解。勿用強酸強

4、堿調(diào)節(jié)pH 值，否則將可能導致沉淀。2. 重力純化法 Ni-NTA Column 準備 1. 溫和地顛倒瓶中的Ni-NTA Agarose 數(shù)次。2. 吸取2ml的樹脂加入15ml離心管中，使樹脂在重力(510 minutes)或低速離心(5 minute at 500 g)，輕柔的吸出上清。3. 加入5ml的無菌蒸餾水，溫和的顛倒柱子3min，離心 5 minute at 500 g，輕柔的吸出上清。4. 用bingding buffer 重復第3步。5. 在Ni 柱中加入等體積的bingding buffer，制成50%的slurryNi柱子的beads浸泡在20% ethanol中，傾除

5、20% ethanol溶液，用蒸餾水將beats調(diào)成75%（v/v）的濃漿狀的凝膠。.沿玻璃棒一次倒入柱子中，靜置。3. 樣品與Ni 柱結合1. 每1ml 50%的slurry中加入4ml 的樣品。1ml 50%的slurry 可結合20mg His-蛋白2. 將混合物室溫，低速振蕩孵育1h4. Buffer 洗滌及洗脫1. 離心 5 minute at 500 g，輕柔的吸出上清。上清保存放在4 for SDS-PAGE analysis。2. 用1 ml Binding Buffer洗滌柱子，在搖床上溫和的振蕩2min，然后低速離心 5 minute at 500 g ，小心吸出上清，重復

6、該步一次。上清保存放在4C for SDS-PAGE analysis。3. 用0.5 ml Elution buffer洗脫柱子，方法同4。重復該步三次。分管收集4次洗脫液，存放在4C for SDS-PAGE analysis。純化柱的再生： 如果純化同一種蛋白，Ni-NTA resin不需要再生，可以重復使用57次。1. 用5倍柱體積的含50 mM EDTA，20 mM 磷酸鹽，0.5 M NaCl pH 7.4的buffer 洗滌柱子，洗去螯合的鎳離子。2. 用5倍柱體積的binding buffer洗滌柱子3. 用5倍柱體積的無菌去離子水洗滌柱子4. 用0.5倍柱體積的含0.1 M

7、的NiSO4的無菌水溶液裝填5. 用5倍柱體積的無菌去離子水洗滌柱子6. 用5倍柱體積的bingding buffer洗滌柱子7. 加入20的乙醇4-30長期保存。lysis buffer中加咪唑的目的是與雜蛋白競爭，使那些與填料親和力弱的雜蛋白不能掛柱；wash buffer中加咪唑是為了洗去大部分已掛柱的雜蛋白（也會洗去少量目的蛋白）；elution buffer中加梯度咪唑，而且咪唑濃度漸高，是咪唑和目的蛋白競爭性結合填料，從而把目的蛋白從柱上洗脫。層析柱再生1. 除鎳 10倍柱床體積的stripping buffer洗柱，1ml/min 10倍柱床體積的binding buffer洗柱

8、，1ml/min (可省) 10倍柱床體積的ddH2O洗柱，1ml/min2. 除去柱上殘余蛋白 1M NaOH充滿柱并保持2h 10倍柱床體積的binding buffer洗柱，1ml/min (可省) 10倍柱床體積的ddH2O洗柱，1ml/min3. 掛鎳 0.5倍柱床體積的0.1NiSO4洗柱，1ml/min 5倍柱床體積的ddH2O洗柱，1ml/min 5倍柱床體積的binding buffer洗柱，1ml/min4. 20%乙醇過柱，4保存注： stripping buffer：2 mM Na3PO4 0.5 M NaCl 50 mM Na2EDTA pH 7.4 蛋白純化Elution buffer 洗柱 10倍柱床體積的binding buffer平衡 樣品過濾，上樣（關閥門，15min） 10倍柱床體積的binding buffer洗柱 Elution buffer 洗脫蛋白（一般蛋白位于前5ml） 超濾管10000rpm，濃縮離心10min注： 500mlBinding buffer：20 mM Na3PO4 2010-30.5380.16=3.8g 0.5 M NaCl 0.50.558.5=14.625g 5mM 咪唑 510-30.568.09=0.17gpH 7.4 （咪唑濃度是蛋白依賴