Western-Blot基本原理、過程及注意事項

1、Western Blot基本原理、過程及注意事項原理是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。主要有三個過程：蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜、檢測。樣品的準備樣品種類主要有培養(yǎng)的細胞、組織（需磨碎）、特殊細胞（切割下來的腫瘤細胞）等。 1、 裂解液主要有RIPA和三去污兩種，RIPA適用于細胞質(zhì)中蛋白檢測，而三去污適用于總蛋白。三去污又分為離子型和非離子型。離子型的裂解能力較強如SDS等，非離子型的包括NP-40、Tritonx-100。2、 裂解液的成分， 作用試劑增加離子強度NaclpHTris-鹽酸緩沖液裂解

2、劑SDS溶劑水蛋白酶抑制劑PMSF 、Cocktail等磷酸酶抑制劑Cocktail等3、 樣品緩沖液 sample buffer作用試劑增加負電SDSpHTris緩沖液抗氧化DTT密度甘油指示劑溴酚藍備注：1、樣品應(yīng)保持低溫，且實驗過程應(yīng)低溫操作，此舉為了抑制酶的活性。裂解完后樣品液會顯得粘稠是長結(jié)構(gòu)DNA所致，故需要勻漿，打斷DNA。一般不用超聲，因為容易引起蛋白不可逆的變性。2、用2X樣品緩沖液與樣品1：1混勻。4度保存。3、樣品混合液加樣前需要100或沸水浴加熱3-5分鐘并迅速插入冰中，以充分變性蛋白。配膠：膠的主要成分為丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫熱(以利于溶解雙丙稀酰胺

3、)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)儲于棕色瓶，4避光保存。4、 分離膠的配方：以20ml的8分離膠為例：H2O9.3 ml30Acrylamide5.3 ml1.5M Tris（PH8.8）5.0 ml10X SDS0.2 ml10X 過硫酸胺(AP)0.2 mlTEMED0.012ml5、 濃縮膠配方：6ml為例H2O4.1 ml30Acrylamide1.0 ml1M Tris(PH6.8)0.75 ml10X SDS0.06 ml10X 過硫酸胺(AP)0.06 m

4、lTEMED0.006 ml備注：1、制膠是避免產(chǎn)生氣泡，空氣會影響膠的聚合，在蛋白質(zhì)表觀分子量分析時影響大。2、因為有SDS，每次混勻時 不應(yīng)劇烈以免產(chǎn)生過多氣泡。3、蛋白容易與SDS脫離而失去負電荷,因此膠中加入SDS為了給蛋白持續(xù)的負電荷。4、墊條清洗干凈，與制膠板壓緊，避免漏膠。5、制膠時，加水應(yīng)緩慢不要破壞膠面，其作用：可以平衡膠面，趕氣泡等。膠固定后用濾紙吸除干凈，有水跑膠時條帶會歪。6、先插梳子再灌濃縮膠。溴酚藍快跑出膠時停止。轉(zhuǎn)膜根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC)

5、和PVDF膜。NC膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負電荷的蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45m和0.2m兩種規(guī)格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2m的膜了，如用0.45m的膜就會發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但PVDF膜在使用之前必需用

6、純甲醇浸泡濕透。 裝配轉(zhuǎn)移根據(jù)三明治原則：海綿層濾紙膠膜層濾紙海綿。膜應(yīng)先浸入純甲醇濕透。每層放好后，加緊夾板。切記：將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入“三明治”（黑色面對黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，250mA，2h。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出蛋白膜。備注：1、整個過程保持膜的濕潤不能干掉。干會產(chǎn)生氣泡。轉(zhuǎn)膜時氣泡處蛋白會跑向旁邊。2、膜入甲醇時斜而慢，避免產(chǎn)生氣泡。3、轉(zhuǎn)膜緩沖液一般不加SDS，但大槽時因?qū)щ娦圆钚杓由倭?，加甲醇用于維持膜與水的相親性。4、由于甲醇易揮發(fā)，加入15-20甲醇時應(yīng)帶蓋混勻。5、三明治插到槽中時，槽中需要有液體。6、電流不能過高， 高電流易產(chǎn)熱， 過熱會使條帶擴散。封閉1用25 ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動。2置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動。備注：1、封閉緩沖液可用0.5%牛血清白蛋白，但價貴。常用5%脫脂奶粉。2、封閉的作用是結(jié)合膜上其他的活性位點，防止抗體與之結(jié)合。3、一般室溫輕搖1-2h，也可以4度過夜，或者37度0.5h（一般背景會高）。免疫雜交與顯色115ml TBS/T洗3次（5 min/T）。2加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或 4C過夜，緩慢搖動。315 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。4加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP