Western-Blot基本原理、過(guò)程及注意事項(xiàng)

1、Western Blot基本原理、過(guò)程及注意事項(xiàng)原理是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。主要有三個(gè)過(guò)程：蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜、檢測(cè)。樣品的準(zhǔn)備樣品種類(lèi)主要有培養(yǎng)的細(xì)胞、組織（需磨碎）、特殊細(xì)胞（切割下來(lái)的腫瘤細(xì)胞）等。 1、 裂解液主要有RIPA和三去污兩種，RIPA適用于細(xì)胞質(zhì)中蛋白檢測(cè)，而三去污適用于總蛋白。三去污又分為離子型和非離子型。離子型的裂解能力較強(qiáng)如SDS等，非離子型的包括NP-40、Tritonx-100。2、 裂解液的成分， 作用試劑增加離子強(qiáng)度NaclpHTris-鹽酸緩沖液裂解

2、劑SDS溶劑水蛋白酶抑制劑PMSF 、Cocktail等磷酸酶抑制劑Cocktail等3、 樣品緩沖液 sample buffer作用試劑增加負(fù)電SDSpHTris緩沖液抗氧化DTT密度甘油指示劑溴酚藍(lán)備注：1、樣品應(yīng)保持低溫，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)低溫操作，此舉為了抑制酶的活性。裂解完后樣品液會(huì)顯得粘稠是長(zhǎng)結(jié)構(gòu)DNA所致，故需要?jiǎng)驖{，打斷DNA。一般不用超聲，因?yàn)槿菀滓鸬鞍撞豢赡娴淖冃浴?、用2X樣品緩沖液與樣品1：1混勻。4度保存。3、樣品混合液加樣前需要100或沸水浴加熱3-5分鐘并迅速插入冰中，以充分變性蛋白。配膠：膠的主要成分為丙烯酰胺和N，N-亞甲雙丙烯酰胺，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀酰胺

3、)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀酰胺29g，N，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)儲(chǔ)于棕色瓶，4避光保存。4、 分離膠的配方：以20ml的8分離膠為例：H2O9.3 ml30Acrylamide5.3 ml1.5M Tris（PH8.8）5.0 ml10X SDS0.2 ml10X 過(guò)硫酸胺(AP)0.2 mlTEMED0.012ml5、 濃縮膠配方：6ml為例H2O4.1 ml30Acrylamide1.0 ml1M Tris(PH6.8)0.75 ml10X SDS0.06 ml10X 過(guò)硫酸胺(AP)0.06 m

4、lTEMED0.006 ml備注：1、制膠是避免產(chǎn)生氣泡，空氣會(huì)影響膠的聚合，在蛋白質(zhì)表觀(guān)分子量分析時(shí)影響大。2、因?yàn)橛蠸DS，每次混勻時(shí) 不應(yīng)劇烈以免產(chǎn)生過(guò)多氣泡。3、蛋白容易與SDS脫離而失去負(fù)電荷,因此膠中加入SDS為了給蛋白持續(xù)的負(fù)電荷。4、墊條清洗干凈，與制膠板壓緊，避免漏膠。5、制膠時(shí)，加水應(yīng)緩慢不要破壞膠面，其作用：可以平衡膠面，趕氣泡等。膠固定后用濾紙吸除干凈，有水跑膠時(shí)條帶會(huì)歪。6、先插梳子再灌濃縮膠。溴酚藍(lán)快跑出膠時(shí)停止。轉(zhuǎn)膜根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。用于Western blot的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC)

5、和PVDF膜。NC膜是蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來(lái)。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45m和0.2m兩種規(guī)格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2m的膜了，如用0.45m的膜就會(huì)發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測(cè)。但PVDF膜在使用之前必需用

6、純甲醇浸泡濕透。 裝配轉(zhuǎn)移根據(jù)三明治原則：海綿層濾紙膠膜層濾紙海綿。膜應(yīng)先浸入純甲醇濕透。每層放好后，加緊夾板。切記：將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入“三明治”（黑色面對(duì)黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，250mA，2h。注意：應(yīng)再次檢查三明治和電極是否裝配正確，電源是否接通。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出蛋白膜。備注：1、整個(gè)過(guò)程保持膜的濕潤(rùn)不能干掉。干會(huì)產(chǎn)生氣泡。轉(zhuǎn)膜時(shí)氣泡處蛋白會(huì)跑向旁邊。2、膜入甲醇時(shí)斜而慢，避免產(chǎn)生氣泡。3、轉(zhuǎn)膜緩沖液一般不加SDS，但大槽時(shí)因?qū)щ娦圆钚杓由倭浚蛹状加糜诰S持膜與水的相親性。4、由于甲醇易揮發(fā)，加入15-20甲醇時(shí)應(yīng)帶蓋混勻。5、三明治插到槽中時(shí)，槽中需要有液體。6、電流不能過(guò)高， 高電流易產(chǎn)熱， 過(guò)熱會(huì)使條帶擴(kuò)散。封閉1用25 ml TBS 洗膜5min，室溫，搖動(dòng)。2置膜于25 ml 封閉緩沖液中1h, 室溫，搖動(dòng)。備注：1、封閉緩沖液可用0.5%牛血清白蛋白，但價(jià)貴。常用5%脫脂奶粉。2、封閉的作用是結(jié)合膜上其他的活性位點(diǎn)，防止抗體與之結(jié)合。3、一般室溫輕搖1-2h，也可以4度過(guò)夜，或者37度0.5h（一般背景會(huì)高）。免疫雜交與顯色115ml TBS/T洗3次（5 min/T）。2加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育1-2h或 4C過(guò)夜，緩慢搖動(dòng)。315 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。4加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP