胰島素生產(chǎn)流程圖

1、胰島素(E.Coli),人胰島素碳水化合物代謝和體細(xì)胞供能,一級結(jié)構(gòu)：51個氨基酸 雙鏈（A：21，B：30） 分子量：5734 g/mol 等電點(diǎn)：5.4,胰島素產(chǎn)生受損導(dǎo)致糖尿病,人胰島素的制備方法,人胰腺提取-原料來源有限 通過單個氨基酸化學(xué)合成-生產(chǎn)成本太高 豬胰島素轉(zhuǎn)化或“半合成”-成本高，來源少 基因工程菌發(fā)酵 -雙鏈Genentech,開發(fā)，Eli Lilly 放大 -胰島素原（82個氨基酸，胰島素的前體） -分泌法（Yeast），Novo Nordisk產(chǎn)業(yè)化 -細(xì)胞內(nèi)法（E.coli），表達(dá)121+82個氨基酸的Trp-LE-Met-proinsulin包涵體，Eli Lil

2、ly 產(chǎn)業(yè)化,E.Coli胰島素原法轉(zhuǎn)化流程,市場分析和設(shè)計(jì)基礎(chǔ)（2005）,糖尿病人數(shù)：美國1800萬，全世界1.5-2.0億，年增長率3-4% 胰島素年銷售額35-40億美元, 由Novo Nordisc、Eli Lilly和Sanofi Aventis三家壟斷 每個患者每年購買胰島素的花費(fèi)：$250-750 每個病人每年平均用量：0.5克純胰島素 對1.5-2.0億患者，年需求75-100噸純胰島素 目前年產(chǎn)量20-30噸純胰島素 設(shè)計(jì)年產(chǎn)量：1800kg純胰島素，滿足350萬人 年工作330天，每48小時生產(chǎn)一批次，每年160批次 每批次發(fā)酵液體積：37.5立方米， 發(fā)酵罐空罐體積：5

3、0立方米,人重組胰島素（E.coli）生產(chǎn)流程,發(fā)酵工段 初回收工段 反應(yīng)工段 終純化工段,通氣量： 0.5VVM,空罐體積：50立方米 前接2級種子罐 發(fā)酵周期：18小時 發(fā)酵溫度：37度 終菌密度：30克（干重）/升 包涵體含量：干重的20% 終保溫：10度,發(fā)酵工段,初回收工段物料溫度保持10度,-三個平行的碟片式離心機(jī)收獲菌體 -菌液從37000L濃縮到9165L菌泥 -菌體收率98%,加與菌泥等體積的緩沖液(96.4%w/w WFI注射用水, 0.7%EDTA, 和2.9% TRIS-base)稀釋,有利于菌體碎片與包涵體分離,三次高壓勻漿機(jī)破菌釋放包涵體 壓降800bar,終物料體

4、積： 1400L,用前面的碟片式離心機(jī)回收包涵體收率98%,加2倍體積的清洗劑(0.66% Triton-X100), 洗滌包涵體,反應(yīng)工段溶解包涵體,玻璃反應(yīng)釜內(nèi)加終濃度為300g/L(5M)的尿素（溶解變性蛋白）和40g/L的 2-巰基乙醇（減少二硫鍵的結(jié)合）,反應(yīng)時間：8小時 溶解收率：95%,包涵體內(nèi)Trp-LE-Met-proinsulin 含量 ：80% w/w,WFI透析6小時， 收率98%， 去除尿素和 2-巰基乙醇,過濾去除細(xì)小顆粒，保護(hù)后續(xù)層析柱。 終體積5200L,再次離心，去除菌體碎片和可溶性蛋白 共用前面回收工段的碟片離心機(jī),反應(yīng)工段嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解為12

5、1個氨基酸的Trp-LE-Met和82個氨基酸的Proinsulin,70%甲酸溶液 30倍過量加入CNBr (理論摩爾比1:1) 收率95%,反應(yīng)時間：12小時 反應(yīng)溫度：20度 利用前面溶解反應(yīng)釜,在CNBr沸點(diǎn)35度旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)1小時,會產(chǎn)生少量有毒氰化物氣體，現(xiàn)場應(yīng)準(zhǔn)備次氯酸鹽,亞硫酸分解的目的是打開胰島素原和二硫鍵，給半胱氨酸加上SO3部分,pH 9-11，50%w/w(6M)鹽酸胍，0.35%碳酸氫銨，3%硫酸鈉，1.5%過硫酸鈉，反應(yīng)時間12小時，收率95%,WFI透析至鹽酸胍濃度為20%w/w,共用前面包涵體溶解過程的透析器,反應(yīng)工段再折疊,三個平行陽離子交換層析床純化proinsulin,床直徑：140cm 床高度：25cm 填料：SP Sepharose FF, GE 洗脫液：29% w/w尿素，1.5%NaCl, 69.