病毒滴度測(cè)定

1、可以采用倍比稀釋來(lái)測(cè)定病毒的滴度 第一個(gè) Ep 管中加入 10uL 病毒原液，記為 1E+1 uL ；第二個(gè) Ep 管中進(jìn)行了第一次十倍稀釋，所得病 毒原液為第一個(gè) Ep 中的 1/10 ，記為 1E+0 uL ； 第三個(gè) Ep 管中進(jìn)行了第二次十倍稀釋，所得病 毒原液為第二個(gè) Ep 中的 1/10 ，記為 1E-1 uL ； 依次類推第七個(gè) Ep 管中進(jìn)行了第六次十倍稀釋，所得病 毒原液為第六個(gè) Ep 中的 1/10 ，記為 1E-5 uL ； 第八個(gè) Ep 管中進(jìn)行了第七次十倍稀釋，所得病 毒原液為第七個(gè) Ep 中的 1/10 ，記為 1E-6 uL ； 換句話說(shuō)：如果在加入 1E-5 u

2、L 病毒原液的孔 中觀察到 3 個(gè)帶有熒光的細(xì)胞， 說(shuō)明該孔中至少 有 3 個(gè)病毒顆粒感染了細(xì)胞， 則該病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量， 本例子中 就是 3/(1E-5)=3E+5 ，單位為 TU/ uL ，也就等 于 3E+8 TU/mL 。稀釋計(jì)數(shù)法滴度單位：TU/mL,指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。TU為 transducing units 的縮寫，中文為轉(zhuǎn)導(dǎo)單位 ，表示可以感染并進(jìn)入到靶 細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)。第一天 細(xì)胞準(zhǔn)備將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293 T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1 X 100 OOO/mL，加入96孔 板，100卩L/孔，為每個(gè)病毒準(zhǔn)備10個(gè)孔。放入

3、37 C, 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。第二天 加病毒在 EP 管中做 10 倍梯度稀釋， 連續(xù) 10 個(gè)稀釋度。 稀釋方法如下： 每種病毒準(zhǔn) 備10個(gè)1.5mL EP管，每管加入90卩L培養(yǎng)液，往第一個(gè)管中加入10卩L 病毒原液，混勻后，吸取10卩L加入第二個(gè)管混勻。依此類推，做十個(gè)稀釋度 (100.00000001 )。吸取 96 孔板中原有的培養(yǎng)基，加入含稀釋好的病毒液。并做好標(biāo)記。第三天 追加培養(yǎng)液在每個(gè)孔再加入100卩L完全培養(yǎng)液，利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。第四天 觀察結(jié)果并計(jì)算滴度在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果， 并數(shù)出最后兩個(gè)有熒光的熒光細(xì)胞克隆數(shù)。 假設(shè)為 X 和丫，則滴度(TU/mL = (X

4、+YX 10)X 1000/2/X 孔的病毒液的含量(卩L)。 定量 PCR 法病毒感染 1 天前，取 6 孔板接種 HOS 細(xì)胞。每孔細(xì)胞為 5X 100 000 個(gè)。 接種細(xì)胞 24 小時(shí)后，取兩個(gè)孔的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)， 確定感染時(shí)細(xì)胞的實(shí) 際數(shù)目，記為 N 。棄去其他培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，更換為含有 5卩g/mL polybrene的新鮮培養(yǎng)基。 將濃縮病毒用培養(yǎng)基稀釋200倍，也就是取1卩L病毒加入到199卩L的培 養(yǎng)基中。在3個(gè)培養(yǎng)孔中分別加入0.5卩L，5卩L和50卩L的稀釋病毒。 感染開始后20小時(shí)，除去培養(yǎng)上清，換為500卩L含DNasel的新鮮培養(yǎng)基。 在37 C消化15分鐘

5、，這一步是要除去殘余的質(zhì)粒 DNA然后換為2 mL正常 的培 養(yǎng)基， 繼續(xù)培養(yǎng) 48 小時(shí)。用0.5 mL 0.25% 胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，在37 C放置1分鐘。用培養(yǎng)基 吹洗下，離心收集細(xì)胞。按照 DNeasy 試劑盒的說(shuō)明抽提基因組 DNA 。每個(gè)樣 品管中加入200卩L洗脫液洗下DNA。用DNA定量試劑盒定量(Bio-Rad )。 基因組 DNA 可以穩(wěn)定保存在 -20 C 至少兩個(gè)月。準(zhǔn)備 PCR 所需的試劑和樣品。為病毒序列檢測(cè)引物配總管Forward primer(100 pmol/mL): 0.1 卩 L x nReverse primer(100 pmol/mL): 0

6、.1 卩 L x nProbe (100 pmol/mL) : 0.1 卩 L x n水：19.7 卩 L x nn = number of reactions 。例如:總反應(yīng)數(shù)為 40 ，將 1 mL2x TaqMan Universal PCRMaster Mix, 4 卩 L forward primer , 4 卩 L reverse primer , 4 卩 L probe 和788卩L水混和。震蕩后放在冰上。2x TaqMan Master Mix : 25 卩 L x n10x RNaseP primer/probe mix : 2.5 卩 L x n水：17.5 卩 L x n

7、n = number of reactions 。例如:總反應(yīng)數(shù)為 40 ，將 1 mL2x TaqMan Universal PCR Master Mix, 100 卩 L 10 x RNaseP primer/probe mix 和 700 卩 L 水混和。 震蕩后放在冰上。在預(yù)冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管I中各取45卩L加入 到A-D各行的孔中，從總管II中各取45卩L加入到E-G各行的孔中。 分別取5卩L質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組 DNA加入到A-D行中，每個(gè)樣品 重復(fù)1次。另留1個(gè)孔加入5卩L的水做為無(wú)模板對(duì)照(no-templatecontrol )。分別取5卩L

8、基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組 DNA加入到E-G行中，每個(gè)樣 品重復(fù)1次。另留1個(gè)孔加入5 L的水做為無(wú)模板對(duì)照(no-template control )。所使用定量PCR儀為ABI PRISM7000定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50C 2分 鐘，95E 10分鐘，然后是95 C 15秒，60C 1分鐘的40個(gè)循環(huán)。 數(shù)據(jù)分析：測(cè)得的 DNA 樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定， 得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度(integration units per mL ， IU/mL)的計(jì)算公式如下：IU/mL= (C xNx Dx 1000)/V其中： C = 平均每基因組整合的病毒

9、拷貝數(shù)； N = 感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目(約為 1x 100000) D = 病毒載體的稀釋倍數(shù) ；V = 加入的稀釋病毒的體積數(shù)。96孔板病毒滴定實(shí)驗(yàn)方法總結(jié)一看了前面一個(gè)關(guān)于病毒滴定方法的帖子 ,自己也做過(guò)不少次 , 所以想寫出一點(diǎn)兒 , 算是個(gè)總結(jié) ,希望能對(duì)各位有所幫助 . 這里我寫 2 種方法,一種是在稀釋好的病毒 液里加細(xì)胞懸液 . 另一種是在長(zhǎng)成單層的細(xì)胞上 ,加入已經(jīng)稀釋好的病毒液 . 這兩 種方法我都做過(guò) , 效果各有長(zhǎng)處 .1. 一個(gè)確定的地方是 ,所用細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng) ,所以在維持液或者生長(zhǎng)液中都不能 加入胰酶 , 這一點(diǎn)和流感病毒病毒滴定測(cè)定有很大不同 ;2. 稀釋液配方:ME

10、M或DMEM)+1雙抗+NaHCO加入量由所需要pH值確定，一般以 加到pH7.0為主,可用pH試紙測(cè)定，NaHCO3勺濃度為6%).另,MEM或DMEI的選擇 由所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞決定 ;3. 細(xì)胞懸液為細(xì)胞+生長(zhǎng)液(MEM+10小牛血清+3浴氨酰胺+1液抗+NaHCO3)在 加細(xì)胞懸液的病毒滴定測(cè)定方法中 , 如果不加入細(xì)胞生長(zhǎng)液 , 則細(xì)胞無(wú)法貼壁 ;方法一. 在稀釋好的病毒液中加入細(xì)胞懸液 :1. 一個(gè)確定的地方是 , 所用細(xì)胞是貼壁生長(zhǎng) ,所以在維持液或者生長(zhǎng)液中都不能 加入姨酶 , 這一天和流感病毒病毒滴定測(cè)定有很大不同 ;2. 稀釋液配方：MEM或DMEM）+1雙抗+NaHC03加

11、入量由所需要pH值確定，一般以 加到pH7.0為主，可用pH試紙測(cè)定，NaHC03勺濃度為6%）.另,MEM或DMEI的選擇 由所培養(yǎng)的宿主細(xì)胞決定；3. 細(xì)胞懸液為細(xì)胞 +生長(zhǎng)液 ：MEM+10小牛血清+3浴氨酰胺+1液抗+NaHC03加細(xì)胞懸液的病毒滴定測(cè)定方法中 , 如果不加入細(xì)胞生長(zhǎng)液 , 則細(xì)胞無(wú)法貼壁 ； 4.96 孔板上做 10 倍稀釋病毒 , 從 10-1 開始, 一般做 5-6 個(gè)稀釋度 , 即到 10-5 或 10-6 即可, 每孔 25微升, 每個(gè)稀釋度做 4孔, 或者 8孔, 一般做 4孔即可；5. 消化細(xì)胞 , 并用生長(zhǎng)液反復(fù)吹打細(xì)胞 , 使細(xì)胞充分混允 , 放入雙碟

12、 , 用排槍將細(xì) 胞懸液加入相應(yīng)孔中 , 每孔 100 微升 ；6. 細(xì)胞對(duì)照孔 ：125 微升細(xì)胞懸液 , 不加病毒；7. 關(guān)于 96 孔板, 每孔接種的細(xì)胞量 ： 一般在此種測(cè)定病毒滴度的方法下 , 要將細(xì) 胞密度適當(dāng)調(diào)低 , 至少要比正常傳代時(shí)低一些 , 否則細(xì)胞生長(zhǎng)速度過(guò)快 , 未到 7 天 則細(xì)胞出現(xiàn)死亡，對(duì)觀察CPE不利.一般情況下，小塑料瓶（8-9ml液體為正常用 量）, 培養(yǎng)長(zhǎng)慢單層后 , 消化細(xì)胞 , 加入 6ml 培養(yǎng)液, 吹勻, 吸出其中的 2ml, 到另外 的瓶子, 在該瓶中加入 14-16ml 即可, 如果不放心 , 可以用顯微鏡看一下 , 細(xì)胞數(shù) 過(guò)多則補(bǔ)加培養(yǎng)液

13、, 少則補(bǔ)加剩余 4ml 的細(xì)胞懸液 ；8.37OC, 5%CO2培養(yǎng)7天左右,每天觀察結(jié)果,從出現(xiàn)CPE的第一天開始記錄,一 般第 7 天可以計(jì)算病毒滴度 ；9. 計(jì)算公式,比較復(fù)雜,明天再附上,這里介紹一個(gè)簡(jiǎn)單的計(jì)算TCID50的方法：由以上公式求得0.6加到僅高於50 %感染率稀釋指數(shù)（此例中為10-3 ）得 10-3.6即為病毒作10-3.6稀釋後每0.1ml含1 TCIP50,亦即該病毒之力價(jià)為 10-3.6/0.1ml 。這里是以每個(gè)稀釋度 8孔為例, 如果做的是 4孔一個(gè)稀釋度 , 則對(duì)應(yīng)的換一下數(shù)字 即可.（ 這里是轉(zhuǎn)自別人的帖子 , 但是我用了之后覺得比那個(gè)很長(zhǎng)的公式容易得多

14、 , 所以推薦給大家 ）10. 本方法的優(yōu)點(diǎn) ： 不容易污染 ；缺點(diǎn)： . 細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng) , 出結(jié)果所需時(shí)間也長(zhǎng) , 一般要到第 7 天才能計(jì)算病毒滴度 ； . 病毒本身有毒性 , 所以對(duì)細(xì)胞的貼壁造成一定影響 , 這也是此法中細(xì)胞生長(zhǎng) 慢的原因之一 ； . 不容易控制細(xì)胞數(shù)量 , 需要經(jīng)驗(yàn) , 一旦細(xì)胞數(shù)量過(guò)多 , 則不到第 7 天細(xì)胞大量 死亡，無(wú)法判斷CPE若細(xì)胞數(shù)量過(guò)少，則細(xì)胞無(wú)法正常生長(zhǎng)，不能正常增殖，也是 造成無(wú)法判斷CPE的原因之一；還有另外一種方法 , 明天再寫 . 如果有什么不恰當(dāng)?shù)牡胤?, 希望有經(jīng)驗(yàn)的高手多多 指教 , 希望大家能多多交流 , 謝謝!4. 維持液, 即病毒培養(yǎng)液 , 配方為： .MEM+2小牛血清+3浴氨酰胺+1液抗+NaHCO