CR技術(shù)及其延伸與應(yīng)用.ppt

1、PCR技術(shù)及其延伸與應(yīng)用,劉紅亮 05.03.08,聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反(Polymerase Chain Reaction, PCR）又稱(chēng)無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)(“free bacteria”cloning technique) 特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的新方法。 在數(shù)小時(shí)內(nèi)可使幾個(gè)拷貝的模板序列甚至一個(gè)DNA分子擴(kuò)增107108倍，大大提高了DNA的得率,PCR技術(shù)最早由美國(guó)Cetus公司人類(lèi)遺傳研究室Kary Mullis及同事于1985年發(fā)現(xiàn)并研制成功的； 最早的應(yīng)用報(bào)道是Saiki等1985年將PCR技術(shù)應(yīng)用于-珠蛋白基因擴(kuò)增和鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷。 使用1976年Chi

2、en等分離的熱穩(wěn)定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大為簡(jiǎn)化，并使PCR自動(dòng)化成為可能； 1987年Kary Mullis等完成了自動(dòng)化操作裝置，使PCR技術(shù)進(jìn)行實(shí)用階段,PCR已獲得廣泛應(yīng)用,目前，每年都有上千篇文章發(fā)表。 1991年，期刊“PCR方法與應(yīng)用”（PCR Methods and Application）在美國(guó)創(chuàng)刊，使有關(guān)學(xué)者有了自己的論壇和參考的專(zhuān)業(yè)期刊。 Kary Mullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。(一名加拿大籍英國(guó)科學(xué)家Michael Smith因開(kāi)創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點(diǎn)誘變”的方法而與Mullis同享此榮,瑞典皇家科學(xué)院說(shuō)：“PCR方

3、法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)中,該方法同DNA測(cè)序法結(jié)合起來(lái)很可能將成為研究動(dòng)植物分類(lèi)學(xué)的一種革新工具?！?現(xiàn)在世界各地都在使用PCR檢測(cè)病人血液中的微量遺傳物質(zhì)，這一成就為精確診斷艾滋病及其它病癥鋪平了道路,PCR技術(shù)作為一種方法學(xué)革命，必將大大推動(dòng)分子生物學(xué)各有關(guān)學(xué)科的研究，使其達(dá)到一個(gè)新的高度,PCR的基本原理和基本程序,變性:先將含有所需擴(kuò)增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開(kāi)為兩個(gè)寡聚核苷酸單鏈， 退火:加入上下游引物，與互補(bǔ)鏈雜交復(fù)性。 延伸:在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5到3方向?qū)⒁镅由?、自?dòng)合成新的DNA鏈、使DNA重新復(fù)制成雙鏈。 循

4、環(huán)擴(kuò)增 每次循環(huán)使延伸的模板增加1倍，亦即擴(kuò)增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴(kuò)增,預(yù)變性 十分鐘延伸 保存,PCR擴(kuò)增屬于酶促反應(yīng)，所以，DNA擴(kuò)增過(guò)程遵循酶促動(dòng)力學(xué)原理。 平臺(tái)效應(yīng) 靶DNA片段的擴(kuò)增最初表現(xiàn)為直線上升，隨著靶DNA片段的逐漸積累，當(dāng)引物模板/DNA/聚合酶達(dá)到一定比值時(shí)，酶的促化反應(yīng)趨于飽和，此時(shí)靶DNA產(chǎn)物的濃度不再增加，即出現(xiàn)所謂平臺(tái)效應(yīng),PCR的特點(diǎn),特異性高-聚合酶 首次報(bào)導(dǎo)用大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段。90會(huì)變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入；同時(shí)引物是在37延伸 Taq DNA聚合酶 1988年Saik

5、i等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的，擴(kuò)增過(guò)程中，單核苷酸的錯(cuò)誤參入程度很低、其錯(cuò)配率一般只有約萬(wàn)分之一,高度敏感： 理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增DNA十億倍以上。 應(yīng)用證實(shí)可以將極微量的靶DNA成百萬(wàn)倍以上地?cái)U(kuò)增到足夠檢測(cè)分析量的DNA。 能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個(gè)感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測(cè),快速 簡(jiǎn)便 可擴(kuò)增RNA或cDNA,試劑,引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測(cè)的DNA不同，選用不同引物。 耐熱的DNA聚合酶： 10PCR緩沖液500mmol/lKCl;100mmol/L Tris-HCl(pH

6、8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。 dNTP貯備液 DNA模板,操作程序,試劑混合 PCR儀程序設(shè)計(jì)：94變性30s，55退火20s，然后在72延伸30s，共循環(huán)30-35次。最后一次循環(huán)結(jié)束后，再將反應(yīng)管置72溫育5min，以確保充分延伸,PCR反應(yīng)基本條件及其對(duì)PCR的影響,模板核酸 有機(jī)溶劑酚 蛋白質(zhì)污染 核酸污染 核酸的量,引 物,引物與PCR的特異性， 引物限定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。 合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。 凍干引物于-20至少保存12-24個(gè)月，液體狀態(tài)于-20可保存6個(gè)月。引物不用時(shí)應(yīng)存于-20保存,緩沖液,

7、緩沖液的目的：給Taq DNA聚合酶提供一個(gè)最適酶催反應(yīng)條件。 目前最為常用的緩沖體系為10-50mmol/LTris-HCl (Tris是一種雙極性離子緩沖液，pH變化于6.8-7.8之間。將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9,有時(shí)會(huì)增加產(chǎn)量。 50mmol/L以?xún)?nèi)的KCl，50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應(yīng)液中以NH+4代K+。 反應(yīng)中加入小牛血清白蛋白（100g/ml）或明膠（0.01%）或Tween 20（0.05% 0.1%） 5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT）有助于酶的穩(wěn)定，尤其在擴(kuò)增長(zhǎng)片段（此時(shí)延伸時(shí)間長(zhǎng)）時(shí),Mg2,Mg2+

8、濃度直接影響著酶的活性與忠實(shí)性。影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度引物二聚體的形成等。 Mg2+濃度過(guò)低時(shí)，酶活力顯著降低；過(guò)高時(shí)，通常會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的累積。 Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+ 。 DNA模板，引物和dNTP 的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實(shí)際濃度,三磷酸脫氧核苷酸dNTP,dNTP是DNA合成的基本原料。 含量太低，PCR擴(kuò)增產(chǎn)量太少、易出現(xiàn)假陰性。 dNTP濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致其錯(cuò)誤摻入（即所謂的“熱力背信”）。一般認(rèn)為最適的dNTP濃度為50200mol/L。 dNTP的質(zhì)量也直接影響PCR反應(yīng)的成敗,耐熱DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶

9、取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段使 PCR得到廣泛應(yīng)用。 Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。 Taq DNA聚合酶簡(jiǎn)化了PCR程序,增加了PCR特異性及PCR擴(kuò)增效率。該酶的最適溫度很高（79）， 100l反應(yīng)液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳， Taq DNA聚合酶保存不當(dāng)而失活是PCR實(shí)驗(yàn)失敗的常見(jiàn)原因,溫度循環(huán)參數(shù),變性溫度與時(shí)間 復(fù)性溫度與時(shí)間 延伸溫度與時(shí)間 循環(huán)數(shù),PCR實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)問(wèn)題對(duì)策,假陰性問(wèn)題 假陽(yáng)性問(wèn)題,假陰性,Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制 引物設(shè)計(jì)不合理 提取的模板質(zhì)

10、量或數(shù)量不過(guò)關(guān)以及 PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng) 循環(huán)次數(shù)不夠,假陽(yáng)性,微量的靶基因污染 標(biāo)本間的交叉污染 樣品中存在有靶基因的同源序列 PCR操作時(shí)要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性吸頭,PCR技術(shù)的延伸,PCR是一種技術(shù)和方法，在使用中不同的人根據(jù)自己的試驗(yàn)?zāi)康?、結(jié)合自己的知識(shí)背景、研究、創(chuàng)造了不同的PCR方法，開(kāi)拓了PCR應(yīng)用的新領(lǐng)域。現(xiàn)在至少有15種不同的PCR用于不同的試驗(yàn),反轉(zhuǎn)錄PCR-Reverse transcription PCR,一種檢測(cè)底豐度特異 的方法 互補(bǔ)靶cDNA生成 雙鏈靶DNA 擴(kuò)增靶DNA,RTPCR反應(yīng)體系,PCR的反應(yīng)體系但是模板是RNA RNA酶抑

11、制劑RNasin 反轉(zhuǎn)錄酶 禽酶禽類(lèi)成髓細(xì)胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus,AMV) 鼠酶莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus,Touch down PCR,一般PCR的體系 一般PCR的設(shè)計(jì)原理 不同的PCR過(guò)程 目的：在不知道理想退火溫度的條件下保證擴(kuò)出產(chǎn)物,梯度PCR,在特殊PCR儀上進(jìn)行的一般PCR 目的：尋找最佳的退火溫度 與TouchDown PCR的區(qū)別 TD PCR：對(duì)同一PCR體系采用不同的退火 溫度進(jìn)行 PCR循環(huán) 梯度PCR：同時(shí)對(duì)多個(gè)PCR體系采用不同的退火溫度進(jìn)行PCR循環(huán),巢（套）式PCR-nested Primer PCR,不同的PCR體系兩對(duì)