實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)

1、實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng),一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1.了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要聯(lián)接方式。 2.了解蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)原理。 3.學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)的方法,實(shí)驗(yàn)原理 (一) 雙縮脲反應(yīng) 1 原理 尿素加熱至180左右生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。 蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測定。 一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽,二) 茚三酮反應(yīng) 除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成

2、藍(lán)紫色物質(zhì)。 該反應(yīng)十分靈敏，是一種常用的氨基酸定量測定方法。 茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原性茚三酮同另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì),加熱,三）黃色反應(yīng) 在蛋白質(zhì)分子中，具有芳香環(huán)的氨基酸(如酪氨酸，色氨酸等)殘基上的苯環(huán)經(jīng)硝酸作用可生成黃色的硝基化合物，在堿性條件下生成物可轉(zhuǎn)變?yōu)樯畛壬牡南貂苌?，反?yīng)為,多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以都會發(fā)生黃色反應(yīng)。苯丙氨酸不易硝化，需加少量濃硫酸后才能夠發(fā)生黃色反應(yīng),四)考馬斯亮藍(lán)反應(yīng) 考馬斯亮藍(lán)G250具有紅色和藍(lán)色兩種色調(diào)。在酸性溶液中，其以

3、游離態(tài)存在呈棕紅色：當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變成藍(lán)色。 它染色靈敏度高。反應(yīng)速度快，約在2分鐘左右時間達(dá)到平衡，在室溫一小時內(nèi)穩(wěn)定。 在0.01-1.0 mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與A595nm值成正比。所以常用來測定蛋白質(zhì)含量,實(shí)驗(yàn)試劑,1 蛋白質(zhì)溶液； 2 0.1茚三酮水溶液； 3 濃硝酸； 4 10%NaOH溶液； 5 尿素； 6 1硫酸銅溶液； 7 0.01考馬斯亮藍(lán)染液,實(shí)驗(yàn)操作 （1）取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10氫氧化鈉溶液約1毫升，振蕩混勻，再加1硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。 （2）向另一試管加卵清蛋白溶液約10滴和10氫氧化鈉溶液約10滴，搖勻，再加1硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖，觀察紫玫瑰色的出現(xiàn),3) 取試管1支，加入蛋白質(zhì)溶液1ml，然后各加入0.1茚三酮水溶液2滴，混勻后于沸水浴中加熱1-2分鐘，觀察顏色由有粉色變紫紅色再變藍(lán)。 (4) 于一試管內(nèi)，置蛋白質(zhì)溶液10滴，濃硝酸3-4滴，加熱，冷卻后于室溫下逐滴加入10%NaOH溶液5滴，觀察顏色變