SNP檢測(cè)技術(shù)[優(yōu)選內(nèi)容]

1、SNP檢測(cè)技術(shù),1,嚴(yán)選內(nèi)容,內(nèi)容簡(jiǎn)介,SNP 概 念,2,嚴(yán)選內(nèi)容,SNP 的概念,單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指由于單個(gè)核苷酸堿基的 改變而導(dǎo)致的核酸序列的多態(tài)性。在不同個(gè)體的同一 條染色體或同一位點(diǎn)的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷 酸序列一致而只有一個(gè)堿基不同的現(xiàn)象，即SNP。 它包括單堿基的轉(zhuǎn)換, 顛換、 插入及缺失等形式,3,嚴(yán)選內(nèi)容,SNP在基因組內(nèi)的形式,一是遍布于基因組的大量單堿基變異; 二是分布在基因編碼區(qū)(coding region) , 稱其 為cSNP，屬功能性突變。 SNP在單個(gè)基因或整個(gè)基因組的分布是不均勻的：

2、 （1）非轉(zhuǎn)錄序列要多于轉(zhuǎn)錄序列 （2）在轉(zhuǎn)錄區(qū)非同義突變的頻率, 比其他方式突變的頻率低得多,4,嚴(yán)選內(nèi)容,SNP 的特點(diǎn),在遺傳學(xué)分析中, SNP 作為一類遺傳標(biāo)記得以廣泛 應(yīng)用, 主要源于這幾個(gè)特點(diǎn): （1）密度高SNP在人類基因組的平均密度估計(jì) 為 11000 bp , 在整個(gè)基因組的分布達(dá) 3106個(gè), 遺傳距離為 23cM , 密度比微衛(wèi)星標(biāo)記更高, 可以 在任何一個(gè)待研究基因的內(nèi)部或附近提供一系列標(biāo) 記。 （2）富有代表性某些位于基因內(nèi)部的SNP 有可 能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達(dá)水平, 因此, 它們可能代 表疾病遺傳機(jī)理中的某些作用因素,5,嚴(yán)選內(nèi)容,SNP 的特點(diǎn),3）遺傳穩(wěn)定

3、性 與微衛(wèi)星等重復(fù)序列多態(tài)性標(biāo) 記相比, SNP 具有更高的遺傳穩(wěn)定性。 （4）易實(shí)現(xiàn)分析的自動(dòng)化SNP標(biāo)記在人群中 只有兩種等位型(allele) 。這樣在檢測(cè)時(shí)只需一個(gè) “ + - ”或“全無(wú)”的方式，而無(wú)須象檢測(cè)限制性片 段長(zhǎng)度多態(tài)性，微衛(wèi)星那樣對(duì)片段的長(zhǎng)度作出測(cè) 量，這使得基于SNP的檢測(cè)分析方法易實(shí)現(xiàn)自動(dòng) 化,6,嚴(yán)選內(nèi)容,一、 SNPs經(jīng)典檢測(cè)方法,一大類是以凝膠電泳為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測(cè)方法,如: 1 . 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法 PCR- RFLP ; 2 .單鏈構(gòu)象多態(tài)性法 PCR- SSCP ; 3 . 變性梯度凝膠電泳 ( dena t ur i ng gradient g

4、el eletrophoresi s DGGE ); 4 .等位基因特異性 PCR ( allele specific PCR, ASPCR )等等,7,嚴(yán)選內(nèi)容,PCR-RFLP方法,原理：利用限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的特異性， 用兩種或兩種以上的限制性內(nèi)切酶作用于同一DNA片 斷，如果存在SNP位點(diǎn)，酶切片斷的長(zhǎng)度和數(shù)量則會(huì) 出現(xiàn)差異，根據(jù)電泳的結(jié)果就可以判斷是否SNP位 點(diǎn)。 特點(diǎn)：該技術(shù)應(yīng)用的前提是SNP的位點(diǎn)必須含有該 限制內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，它是SNP篩查中最經(jīng)典的 方法之一,8,嚴(yán)選內(nèi)容,PCR-RFLP原理圖,9,嚴(yán)選內(nèi)容,單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP,原理：?jiǎn)捂淒NA 在中性條件下會(huì)

5、形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，不同的 二級(jí)結(jié)構(gòu)在電泳中會(huì)出現(xiàn)不同的遷移率。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴 于堿基的組成，單個(gè)堿基的改變也會(huì)影響其構(gòu)象，最終會(huì)導(dǎo) 致在凝膠上遷移速度的改變。 在非變性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈 DNA 和RNA 分 子依其單堿基序列的不同而形成不同的構(gòu)象，這樣在凝膠上 的遷移速率不同，出現(xiàn)不同的條帶，檢測(cè)SNP。 特點(diǎn)：由于該方法簡(jiǎn)單快速，因而被廣泛運(yùn)用于未知基因突變的檢測(cè)。這種方法的弊端在于不能確定突變類型和具體位置,10,嚴(yán)選內(nèi)容,變性梯度凝膠電泳（DGGE,原理：是利用長(zhǎng)度相同的雙鏈 DNA片段解鏈溫 度不同的原理,通過(guò)梯度變性膠將 DNA片段分開 的電泳技術(shù)。 電泳開始時(shí),DNA 在膠

6、中的遷移速率僅與分 子大小有關(guān), 而一旦DNA 泳動(dòng)到某一點(diǎn)時(shí), 即到 達(dá)該DNA 變性濃度位置時(shí), 使得DNA 雙鏈開始 分開,從而大大降低了遷移速率。當(dāng)遷移阻力與電 場(chǎng)力平衡時(shí), DNA 片段在凝膠中基本停止遷移。 由于不同的DNA 片段的堿基組成有差異, 使得其 變性條件產(chǎn)生差異, 從而在凝膠上形成不同的條 帶,11,嚴(yán)選內(nèi)容,12,嚴(yán)選內(nèi)容,等位基因特異 PCR ( AS-PCR,原理：根據(jù) SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物,其中一條鏈(特 異鏈)的3末端與 SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)(或相同) , 另一條鏈(普通鏈)按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計(jì),因此,AS- PCR技術(shù)是一種基于SNP的PCR標(biāo)記。因?yàn)樘禺愐?/p>

7、 物在一種基因型中有擴(kuò)增產(chǎn)物,在另一種基因型中沒(méi) 有擴(kuò)增產(chǎn)物,用凝膠電泳就能夠很容易地分辨出擴(kuò)增 產(chǎn)物的有無(wú),從而確定基因型的 SNP,13,嚴(yán)選內(nèi)容,14,嚴(yán)選內(nèi)容,SNPs高通量的檢測(cè)方法,另一大類檢測(cè)方法是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的, 高通 量、 自動(dòng)化程度較高的檢測(cè) SNPs的方法,較為常用 的有: 1 . DNA測(cè)序法; 2 . DNA芯片檢測(cè); 3 . 飛行質(zhì)譜儀 (MALDI- TOFMS )檢測(cè); 4 . 變性高效液相色譜 ( DH PLC )法等等,15,嚴(yán)選內(nèi)容,DNA測(cè)序法,直接測(cè)序是最容易實(shí)施的SNP檢測(cè)方法。 原理: 通過(guò)對(duì)不同個(gè)體同一基因或基因片段進(jìn)行測(cè) 序和序列比較, 以

8、確定所研究的堿基是否變異, 其檢 出率可達(dá)100%。 特點(diǎn)：可以得到SNP 的類型及其準(zhǔn)確位置等SNP分 型所需要的重要參數(shù),16,嚴(yán)選內(nèi)容,基因芯片技術(shù)( Genechips,原理:是將具有特定堿基序列的探針固定在特殊的 載體上，待測(cè)基因經(jīng)提取、熒光標(biāo)記后，與固定好 的探針進(jìn)行雜交，最后根據(jù)熒光的強(qiáng)度和種類測(cè)出 待測(cè)序列的堿基類別。 特點(diǎn)：基因芯片具有信息量大和自動(dòng)化程度高的 突出優(yōu)點(diǎn)。但它也存在若干問(wèn)題: 芯片造價(jià)高昂, 所 需設(shè)備貴重, 不利于普及應(yīng)用,17,嚴(yán)選內(nèi)容,MALDI-TOF,原理：是將變性的單鏈PCR產(chǎn)物通過(guò)與硅芯片上 的化合物共價(jià)結(jié)合后, 在硅芯片上進(jìn)行引物的退火, 延伸

9、反應(yīng), 突變部位配對(duì)的堿基與正常配對(duì)的堿基 不相同。根據(jù)引物在延伸反應(yīng)中所結(jié)合的不同堿基 的不同質(zhì)量在質(zhì)譜儀上顯示不同峰而檢測(cè)SNP,18,嚴(yán)選內(nèi)容,變性高效液相色譜( DHPLC,原理：目標(biāo)核酸片段PCR擴(kuò)增，部分加熱變性后，含有突變 堿基的DNA序列由于錯(cuò)配堿基與正常堿基不能配對(duì)而形成異 源雙鏈。因包含錯(cuò)配堿基的雜合異源雙鏈區(qū)比完全配對(duì)的同 源配對(duì)區(qū)和固定相的親和力弱，更易被從分離柱上洗脫下來(lái), 從而達(dá)到分離的目的。SNPs的有無(wú)最終表現(xiàn)為色譜峰的峰 形或數(shù)目差異,依據(jù)此現(xiàn)象可很容易從色譜圖中判斷出突變的 堿基。 特點(diǎn)：使用高效液相色譜檢測(cè)SNPs具有檢測(cè)效率高，便于自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)未知S

10、NPs的準(zhǔn)確率可達(dá)95%以上。但DHPLC檢測(cè)對(duì)所用試劑和環(huán)境要求較高,容易產(chǎn)生誤差, 不能檢測(cè)出純合突變,19,嚴(yán)選內(nèi)容,MassARRAY,SNP分型的方法多種多樣，MassARRAY分子量陣列技術(shù) 是Sequenom公司推出的世界上領(lǐng)先的基因分析工具，通過(guò) 引物延伸或切割反應(yīng)與靈敏、可靠的MALDITOF質(zhì)譜技術(shù)相 結(jié)合，實(shí)現(xiàn)基因分型檢測(cè)。 基于MassARRAY 分子量陣列平臺(tái)的iPLEX GOLD技術(shù) 可以設(shè)計(jì)最高多達(dá)40重PCR反應(yīng)和基因型檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)非 常靈活，分型結(jié)果準(zhǔn)確性高。特別適合于對(duì)全基因組研究發(fā) 現(xiàn)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，或者是有限數(shù)量的研究位點(diǎn)已經(jīng)確定的 情況,20,嚴(yán)選內(nèi)

11、容,MassARRAY技術(shù)原理,先通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，然后加入SNP序列 特異延伸引物，在SNP位點(diǎn)上，延伸1個(gè)堿基。將 制備的樣品分析物與芯片基質(zhì)共結(jié)晶后在質(zhì)譜儀的 真空管經(jīng)強(qiáng)激光激發(fā)，核酸分子解吸附為單電荷離 子，電場(chǎng)中離子飛行時(shí)間與離子質(zhì)量成反比，通過(guò) 檢測(cè)核酸分子在真空管中的飛行時(shí)間而獲得樣品分 析物的精確分子量，從而檢測(cè)出SNP位點(diǎn)信息,21,嚴(yán)選內(nèi)容,MassARRAY技術(shù)原理,MassEXTEND單堿基延伸反應(yīng)，緊挨SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一段探針，在反應(yīng)體系中以ddNTP替代dNTP，使探針僅在SNP位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基即終止。根據(jù)SNP位點(diǎn)的不同，探針將結(jié)合不同的ddNTP，從而具有

12、不同的分子量，質(zhì)譜儀即可檢測(cè)出這種分子量差異，從而實(shí)現(xiàn)SNP分型的目的,22,嚴(yán)選內(nèi)容,23,嚴(yán)選內(nèi)容,MassARRAY技術(shù)流程,24,嚴(yán)選內(nèi)容,25,嚴(yán)選內(nèi)容,26,嚴(yán)選內(nèi)容,27,嚴(yán)選內(nèi)容,28,嚴(yán)選內(nèi)容,29,嚴(yán)選內(nèi)容,30,嚴(yán)選內(nèi)容,應(yīng)用,1.確定基因多態(tài)性和疾病的關(guān)系2.解釋個(gè)體間的表型差異對(duì)疾病的易感程度3.對(duì)未來(lái)疾病做出診斷4.研究不同基因型個(gè)體對(duì)藥物反應(yīng)的差異，指導(dǎo)藥物開發(fā)及臨床合理用藥5.個(gè)體間SNP千差萬(wàn)別，通過(guò)SNP檢測(cè)等技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)鑒定及個(gè)體識(shí)別,31,嚴(yán)選內(nèi)容,優(yōu)勢(shì),1）質(zhì)譜儀檢測(cè)的是分子最本質(zhì)的特征之一分子量，不涉及熒光標(biāo)記、凝膠電泳等，就能檢測(cè)一個(gè)堿基的差異，準(zhǔn)確性高，機(jī)器本身出錯(cuò)的概率非常低； （2）質(zhì)譜儀的靈敏度非常高，檢測(cè)窗口內(nèi)，任何pmol級(jí)別的物質(zhì)都能被檢測(cè)出來(lái)； （3）通量高：幾秒就能檢測(cè)完一個(gè)反應(yīng)孔； （4）操作簡(jiǎn)單，儀器要求簡(jiǎn)單，除質(zhì)譜儀外，都是常規(guī)PCR儀器； （5）靈活：每