蛋白鑒定分析

1、蛋白鑒定分析,蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定 1 蛋白質(zhì)分子量測定 DSD-聚丙烯酰胺凝膠電泳 凝膠排阻層析 電噴質(zhì)譜 核磁共振 2 蛋白質(zhì)等電點的測定 聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳 PBE-Sepharose聚焦層析,1概述 1.1什么是蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定 蛋白質(zhì)分析鑒定是蛋白質(zhì)研究中的一個最基本技術(shù),是確定蛋白質(zhì)產(chǎn)品的是與非的問題,尤其是在研究新的蛋白質(zhì)組分時顯得更重要。研究一個新的蛋白質(zhì)首先要從它的基本性質(zhì)作為突破口，然后根據(jù)它的基本性質(zhì)進行分離純化，最終用純品對其進行分析鑒定。如果對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)尚未搞清楚，工作起來將會困難重重。因此，蛋白質(zhì)研究技術(shù)主要是對蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)的進行分析鑒定,1.2蛋白質(zhì)鑒定

2、的主要參數(shù) 蛋白質(zhì)分子是非常復(fù)雜的生物大分子,能代表其特征參數(shù)很多.但在普通實驗室能夠進行測定的、最常用的參數(shù)，歸納起來主要有以下幾種。 (1)蛋白質(zhì)的質(zhì)量鑒定(分子量) (2)蛋白質(zhì)帶電性鑒定（等電點） (3)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定(一、二級結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)、肽譜、N和C-末端) (4)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能鑒定(生物活性、比活、酶促動力學(xué)) (5)免疫學(xué)鑒定（抗原-抗體反應(yīng)、酶聯(lián)免疫反應(yīng),2蛋白質(zhì)鑒定方法 蛋白質(zhì)可鑒定的參數(shù)很多，這里主要介紹蛋白質(zhì)的分子量和等電點兩個主要參數(shù)。 2.1蛋白質(zhì)分子量測定 早期測定蛋白質(zhì)分子量的方法是采用超速離心和光散射等方法。由于這些方法需要高級的精密儀器設(shè)備和大量的蛋白樣

3、品才能進行測定，所以目前采用的不多了。 自從葡聚糖凝膠層析介質(zhì)(Sephadex G系列產(chǎn)品)及排阻層析技術(shù)問世以來，就被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分子量測定。它是目前實驗室測定白質(zhì)分子量常用技術(shù)之一。但是這種層析介質(zhì)剛性較差，在層析過程流速較慢，分離時間長。 近年來又研究出剛性的耐壓的凝膠層析介質(zhì)，被用于高效液相色譜。大大的提高了工作效率和測定精度,隨著聚丙烯酰胺凝膠電泳的出現(xiàn)和發(fā)展，DSD-PAGE電泳成了常用的方法。從90年代初期隨著毛細管電泳的出現(xiàn)，應(yīng)用毛細管電泳無膠篩分技術(shù)來測定蛋白質(zhì)分子量，是一種較好的選擇。 蛋白質(zhì)氨基酸測序技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)和核磁共振波譜技術(shù)的發(fā)展，給蛋白質(zhì)分子量測定技術(shù)增

4、添了新的途徑。尤其是采用電噴質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子量，既快捷有準確。該技術(shù)在生物領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣，是一種快速精確的好方法。 蛋白質(zhì)的分子量測定技術(shù)歸納起來大致分三大類電泳技術(shù)，層析技術(shù)，光譜分析技術(shù),2.1.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，也稱為十二烷基酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。主要用于蛋白質(zhì)亞基分子量的測定。它具有操作簡單，重復(fù)性好，對樣品的純度要求不高等特點，是目前使用較為廣泛的測定蛋白質(zhì)亞基分子量的一種方法,1)原理：

5、a.蛋白質(zhì)分子狀態(tài) 在自然狀態(tài)下蛋白質(zhì)通過二硫鍵聚合形成高度折疊的生物大分子，在水溶液中，由于氨基酸殘基的解離作用使蛋白質(zhì)分子形成帶有一定凈電荷的分子。在電場下向自身電荷相反的方向移動,b. 還原劑的解聚作用 在蛋白溶液和分離凝膠介質(zhì)中加入還原劑-巰基乙醇(- mercaptoethanol)或二硫蘇糖醇(Dithiothretiol, DTT)。蛋白質(zhì)分子在還原劑作用下二硫鍵被還原，將多聚體或單鏈折疊的蛋白質(zhì)分子的二硫鍵打開，形成長短不一的單鏈亞基,c. SDS的包裹作用 SDS分子中含有大量的帶負電的磺酸基。蛋白質(zhì)分子解聚后形成的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合，在SDS的重量達到蛋白重量的3-4倍

6、時蛋白質(zhì)分子表面完全被SDS包裹，形成帶負電荷的蛋白質(zhì)亞基分子，稱之為蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物( protein-SDS micelles)。由于蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物所帶負電荷遠大于蛋白質(zhì)分子自身有的凈電荷，這樣就消除了不同分子之間原有的電荷差異。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在水溶液中的形狀象一個長橢圓棒。這種棒狀物的長短與亞基的分子量大小成正比。在電場下，蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物就會向正極移動，移動的速度與蛋白質(zhì)本身帶是什麼樣的電荷和帶多少電荷無關(guān)，只與橢圓棒狀的長短有關(guān)，也就是與亞基的分子量的大小有關(guān)，利用這一性質(zhì)可以測定蛋白質(zhì)的分子量,d. 聚丙烯酰胺凝膠分子篩作用 不同濃度的凝膠和交聯(lián)度，形成不同大小

7、的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它對蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物具有阻滯作用。在電場下，分子量大的亞基受阻大，電泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亞基受阻小，電泳速度快，走在大分子的前面。不同分子量的亞基受阻程度不同，表現(xiàn)出不同的電泳速度，這樣就把同一樣品中不同大小分子量的亞基分開,2)操作過程 制膠 加樣 電泳 固定 染色 脫色 計算,3)結(jié)果處理 a. 電泳圖譜,1 2 3,b. 標準曲線 繪制標準曲線：以標準蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)log(M)為縱坐標，Rf值為橫坐標，繪制標準曲線,c.未知蛋白分子量計算： 將未知蛋白的mR值查到log(M)值，便可知其分子量。計算分子量方法除了用標準曲線法外,還可以用比較法和機讀法

8、. 比較法: 通常標準蛋白的相對位置與未知蛋白的位置進行比較，初步判斷。這是在發(fā)表論文時常用的表示方法。 機讀法： 用凝膠掃描儀,將凝膠圖譜掃描輸入計算機中，通過影像文件系統(tǒng)處理，便很快得知未知樣品的分子量。但發(fā)表論文時,仍然要注重原始圖譜，經(jīng)計算機處理的圖譜有作假之嫌,4)影響因素 影響SDS-復(fù)合物形成的主要因素。SDS-電泳成敗關(guān)之一，是在制備樣品的過程中，蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的程度直接影響電泳分離效果。影響結(jié)合的因素主要有三個: A、溶液中SDS單體的濃度 SDS在水溶液中以單體和SDS復(fù)合物混合存在的，能與蛋白質(zhì)結(jié)合的只能是單體。單體的濃度與SDS總濃度，溫度和離子強度有關(guān)。在一定溫度

9、和離子強度下，SDS處于一飽和值，即單體濃度不再隨SDS中濃度增加而增加。為了使SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合充分，SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合的重量比一般是4:1或3:1,B、樣品緩沖液離子強度 因為SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上的量取決于平衡時SDS單體濃度，而不是總濃度，只有在較低的離子強度溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度，所以樣品緩沖液應(yīng)選用低離子強度，通常是10-100mmol/l之間。 C、二硫鍵是否完全打開 只有蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵完全被打開，蛋白質(zhì)分子完全解聚，SDS充分與亞基分子結(jié)合，才能準確測定出亞基分子量。二硫鍵完全被打開要取決于巰基乙醇的質(zhì)量和使用的劑量。若蛋白質(zhì)分子的二硫鍵只是部分被打開，

10、這是測出的分子量是蛋白質(zhì)分子和亞基分子的混合物,2.1.2凝膠排阻層析 (1)原理： 凝膠排阻色譜( Exclusion chromatography)，也稱為分子篩層析、凝膠過濾層析。凝膠排阻色譜介質(zhì)是以不同濃度的凝膠交聯(lián)聚合而成的多孔徑的，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的球體。在色譜柱內(nèi)不同大小凝膠的孔徑可以通過不同大小的蛋白質(zhì)分子。因此，凝膠排阻色譜介質(zhì)對蛋白質(zhì)分子具有排阻作用。在凝膠排阻色譜分離的分離過程中，大分子先流出，小分子后流出,2)蛋白質(zhì)分子形狀： 蛋白質(zhì)分子一般有兩種形狀，一種是球形分子，另一種是線性分子。在色譜過程中，大分子不能進入或不能完全進入凝膠內(nèi)部孔徑而沿凝膠顆粒之間的空隙向前移動，遷移距

11、離短，最先流出柱外來。小分子可以進入凝膠內(nèi)部孔徑慢慢向前移動，遷移距離長，最后流出柱外來。線性蛋白質(zhì)分子與球形分子比較，同樣大小分子量的蛋白質(zhì)，線性分子體積大流速快，球形分子體積小流速慢。因此，在凝膠色譜柱中無論是球形分子還是線性分子都可進行分離，但是球形分子比線性分子的分離度好,3) 凝膠層析介質(zhì) 凝膠層析介質(zhì)主要有五類Sephadex, Biogel, Sepharose, utrol gel, perfuson等。 A、葡聚糖凝膠(Sephadex) 葡聚糖凝膠是以葡聚糖為原料合成的珠狀凝膠，其主要技術(shù)指標,后面的阿拉伯數(shù)字越大，表示交聯(lián)越小，凝膠孔徑越大，分子量分離范圍越大。凝膠的溶脹

12、體積。 凝膠性能： 耐高溫100 沸水煮 pH范圍pH211穩(wěn)定 在高鹽濃度下體積易收縮 B、聚丙烯酰胺凝膠(Boigel) Biogel是由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)制成的球狀凝膠色譜介質(zhì)。根據(jù)溶脹性質(zhì)可分Biogel 、P2、P4 P300等10種。其主要技術(shù)指標是,P”后面的拉伯數(shù)字越大，表示吸水性越大，凝膠的交聯(lián)度越小，分子量分離范圍越大與 Sephadex相似。 性能 ： 剛性好流速快 在pH 2-11的溶液中穩(wěn)定 高溫下酰胺基易被水解產(chǎn)生羧酸 對酸、堿性較強的物質(zhì)及芳香族化類合物均用不同程度的吸附,瓊脂糖凝膠Sepharose系列 瓊脂糖凝膠是由瓊脂糖經(jīng)特殊工藝制成的珠狀凝膠，瓊

13、脂糖中凝膠的結(jié)構(gòu)是氫鍵而不是共價鍵，因此,物理穩(wěn)定性較差。通常把瓊脂糖凝膠層析介質(zhì)浸泡在水溶液中。其主要技術(shù)指標是,阿拉伯數(shù)字后面的B表示瓊脂糖凝膠的百分濃度，瓊脂糖濃度越大表交聯(lián)度越大， 分子量分離范圍越小。與此相反瓊脂糖濃度越小表交聯(lián)度越小，分子量分離范圍越大。 性能： 耐溫： 交聯(lián)瓊脂糖凝膠可耐受100120 耐酸堿：在pH312范圍內(nèi)穩(wěn)定 耐鹽：在6M尿素中穩(wěn)定,4)方法 介質(zhì)溶脹 裝柱 平衡 上樣 洗脫 計算分子量 分離過程,5) 結(jié)果處理 a層析圖譜,B、 標準曲線 分子量的測定方法，一般都采用標準曲線法。使用幾種不同分子量的混合標準蛋白，經(jīng)排阻色譜進行分離會得到不同標留值的色譜峰

14、，以分子量的對數(shù)值(lgMr)為縱坐標，以收集體積(ml)為橫坐標，繪制標準曲線圖。然后將未知樣的標流體積在準曲線先上查得分子量,C、未知蛋白分子量計算 將未知蛋白排阻層析的洗脫體積從標準曲線上查到相應(yīng)的log(M)值，便可求出其分子量。 (6)應(yīng)注意的問題： A、樣品: 前處理: 樣液要進行適當?shù)那疤幚? 如離心，沉淀，抽提等 濃度: 樣液濃度不宜太稀 組分: 樣液組分不宜太多，目標組分與相鄰組分之間的分子量至少要相差2000以上。 B、上樣： 對組別分離: 上樣體積不超過柱床體積的30左右 對組分分離: 上樣體積不超過柱床體積的1-2左右,C、流速: 流速是指在單位面積液體所流過的量，排阻

15、色譜要選擇較理想的流速才能得到好的結(jié)果，選擇的原則是： 根據(jù)介質(zhì)顆粒大小選擇 根據(jù)上樣體積 根據(jù)樣品中的組分多少,2.3質(zhì)譜法 2.3.1原理： 質(zhì)譜儀是利用電磁學(xué)的原理，使帶電的樣品離子按質(zhì)荷比進行分離的裝置。離子電離后經(jīng)過加速進入磁場中。其動能與加速電壓及電荷Z有關(guān)。 Z：電荷數(shù) ZeU=mv2/2 e：電荷(e = 1.60 x10-19C) U：加速電壓 m：離子的質(zhì)量 v：離子被加速后的運動速度,具有速度v的帶電離子進入質(zhì)譜儀的電磁場中，根據(jù)所選擇的分離方式，最終實現(xiàn)各種離子按m/z進行分離。 根據(jù)質(zhì)量分析器的工作原理，可將質(zhì)譜儀分為動態(tài)和靜態(tài)儀器兩大類，靜態(tài)儀器采用穩(wěn)定的電磁場，按

16、空間位置來區(qū)別m/z不同的離子。動態(tài)儀器采用變化的電磁場，按時間不同來區(qū)分m/z不同 的離子。 分離生物大分子多采用電噴質(zhì)譜法，屬于動態(tài)質(zhì)譜儀?；驹硎巧锎蠓肿釉诤芨叩碾妶鱿码婋x。樣品溶液以很低的流速，在高的電場下使生物分子從毛細管中流出來,2.3.2方法： 樣品溶液以很低的流速(1-20l/分鐘)從毛細管中流出來。在毛細管的柱頭上施加一個高電壓(1-5kv)，是柱頭液體霧化成很細的帶電液滴，這種帶電液滴在逆向干燥氣流中揮發(fā)，使液滴表面電荷密度增大。直到產(chǎn)生的庫侖斥與液滴表面張力的雷利極限值相等時，液滴就會發(fā)生爆裂，形成更小的子液滴，這些子液滴又被蒸發(fā)，又會形成爆裂。如此循環(huán)下去，直到液滴

17、變得非常小，它的表面的電荷密度變得非常大，形成很強的電場，并從液滴中解離出帶多電荷的分子離子。這些離子是靠吸附上或丟失若干質(zhì)子而形成的，所以正離子或負離子譜上會觀察到譜峰。生物大分子在ESI譜上往往是一組帶不同的電荷的分子離子峰,2.3.3結(jié)果,2.4核磁共振波譜 核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR).是將具有磁矩的核放入磁場后，用適宜的頻率的電磁波照射，它們就會吸收能量，發(fā)生原子核能級的躍遷，同時產(chǎn)生核磁共振信號，得到核磁共振波譜。在有機化合物中，經(jīng)常用于1H和13C核的共振吸收波譜。在生物學(xué)方面主要研究生物大分子的結(jié)構(gòu)和分

18、子量。到目前為止，采用1H 2D-NMR（二維NMR）能解決的最大蛋白質(zhì)分子量在10000Da左右。如果采用雜核多維NMR技術(shù)，能解決的最大蛋白質(zhì)分子量大在25000Da左右,6幾種測定蛋白質(zhì)分子量方法的比較,3蛋白質(zhì)的等電點測定技術(shù) 3.1等電聚焦電泳(Isoelectrofocusing，簡寫IEF) 3.1.1原理 通常是指聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳。它是60年代初建立起來的一種蛋白質(zhì)分離手段，現(xiàn)在已經(jīng)成為單向蛋白質(zhì)電泳分辨率最高的一種分離技術(shù)，其分辨率可以達到0.01個pH值，有的文獻報道可以達到0.001個pH值。它是利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點的差異進行電泳分離和分析。蛋白

19、質(zhì)在一個穩(wěn)定的線性pH梯度的凝膠中電泳，蛋白質(zhì)朝著與自身電荷相反的方向移動，在移動的過程中不斷被凝膠中的反離子中和，最后靜電荷完全被中和而停止運動，聚焦在等電點的位置,3.1.2蛋白質(zhì)與兩性電解質(zhì) (1)載體兩性電解質(zhì)： 在等電聚焦電泳中，載體兩性電解質(zhì)具有以下兩種功能： A 中和功能： 兩性電解質(zhì)的性質(zhì)在分離系統(tǒng)中形成一個平衡穩(wěn)定的pH梯度，提供中和蛋白質(zhì)電荷的離子，具有pH緩沖能。 B 載電功能： 兩性電解質(zhì)作為電的載體，具有運載“電流”的能力，有良好的導(dǎo)電性能,2)蛋白質(zhì)的等電點 蛋白質(zhì)屬于一種兩性電解質(zhì)。在不同的pH環(huán)境中所帶的正負電荷不同。若在某特定的pH環(huán)境中其凈電荷為零，此時的p

20、H為該蛋白質(zhì)的等電點，在電場下不泳動。 3.1.3載體兩性電解質(zhì)分類及pH范圍 根據(jù)建立pH梯度的原理的不同，可以分為載體兩性電解質(zhì)pH梯度(Carrier Ampholytes pH Gradient)和固相pH梯度(Immobilized pH Gradient)。前者是在電場中通過兩性緩沖離子建立pH梯度，后者將緩沖基團作為凝膠介質(zhì)的一部分，分辨率比前者高一個數(shù)量級,3.1.4電極液 根據(jù)不同的pH范圍,選用不同的電極液,見下表,3.1.5方法 制膠 加樣 電泳 固定 染色 脫色 計算 3.1.6 pH值測定 (1)標準曲線法： 標準樣品參照，繪制標準曲線 (2)微電極法： 微電極直接測

21、定,3.2聚焦層析(chromatofocusing) 3.2.1原理 (1)pH梯度的形成 一般的離子交換色譜中，pH梯度的產(chǎn)生，通常利用pH梯度混合器來制造連續(xù)的pH梯度。而聚焦色譜則是利用離子交換劑本身的帶電基團的緩沖作用形成梯度。當洗脫緩沖液通過聚焦離子交換介質(zhì)時，就會自動形成pH梯度。在高pH緩沖液的平衡，使色譜柱內(nèi)的介質(zhì)均處于堿性條件，帶有電負性的堿性基團，根據(jù)載體兩性電解質(zhì)的等電點不同，所帶的電荷有差異而形成pH梯度,2)聚焦效應(yīng) 當一種蛋白質(zhì)在色譜柱內(nèi)隨洗脫液前移至接近其pI處時,此時的移動速度明顯減慢。如果同樣的組分第二次加樣，起初它帶負電荷,向正電荷(低pH)方向移動速度快，直至追上慢速移動的第一次加樣的組分，而聚焦到一起，然后兩次加樣的同一組分一起前移，直至停留在pI處。 3.2. 2 聚焦介質(zhì) 聚焦介質(zhì)是以交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為載體合成的,具有凝膠介質(zhì)的基本特性，也有兩性電解質(zhì)的特性。目前用的較多主要 (1)PBE118偏堿性介質(zhì) (2)PBE94偏中性介質(zhì),3.2.3緩沖液 (1)緩沖液分類 a.起始緩沖液(start buffer)， 如：乙醇胺-HCl b.樣品緩沖液(sample buffer), 如：Tris