酶分子化學(xué)修飾

1、第五章 酶分子的化學(xué)修飾 酶的活性中心 酶化學(xué)修飾的目的 酶化學(xué)修飾的原理 酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì) 酶化學(xué)修飾的應(yīng)用,第一節(jié) 酶的活性中心（active site） 一、活性中心的概念 酶的必需基團(tuán)(essential group): 與酶活性有關(guān)的基團(tuán) 酶的活性中心(active center): 由必需基團(tuán)構(gòu)成的與酶催化活性有關(guān)的特定區(qū)域,酶分子,非必需基團(tuán),必需基團(tuán),活性中心 必需基團(tuán),活性中心外 必需基團(tuán),結(jié)合基團(tuán),催化基團(tuán),非活性中心,活性中心,活性中心的重要化學(xué)基團(tuán) 7種氨基酸出現(xiàn)的頻率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （蘭天果拌豬肉絲） 某些功能基團(tuán),如（氨

2、基、羧基、巰基、羥基 和咪唑基）是酶的必需基團(tuán)。 賴氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巰基 組氨酸的咪唑基 酪氨酸和絲氨酸的羥基,二、活性中心的共性,1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 (2)活性部位是一個(gè)三維實(shí)體。 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。 (4)活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導(dǎo)契合）。 (5)酶與底物通過(guò)鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級(jí)鍵結(jié)合,Active site The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-

3、substrate complex, and transforms it into product. The active site is a three-dimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions,三、研究酶活性中心的方法 1.物理學(xué)方法： 用X射線衍射法直接檢測(cè)底物或其類似物與酶形成的中間復(fù)合物（包括酶和底物）的相對(duì)位置,2.化學(xué)修飾法：根據(jù)所用修飾試劑不同，分

4、為 1)非專一性化學(xué)修飾 用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)作用。 若某基團(tuán)被修飾后： 酶活性不變?cè)摶鶊F(tuán)可能不是酶的必需基團(tuán) 酶活性降低或喪失該基團(tuán)可能是酶的必需基團(tuán) 但不能確定化學(xué)試劑是同活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合,活性中心基團(tuán)的鑒定標(biāo)準(zhǔn) 失活程度與修飾劑濃度成一定比例關(guān)系。 S或可逆抑制劑有保護(hù)作用（活性中心）。 先加S或競(jìng) 加共價(jià)修飾劑 透析除去S或競(jìng) 活性不喪失,差別標(biāo)記： 底物或抑制劑存在 活性基團(tuán)不與修飾劑作用 去除底物或抑制劑 原來(lái)被保護(hù)的基團(tuán)帶同位素標(biāo)記 可直接得到蛋白質(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團(tuán),化學(xué)修飾,含同位素標(biāo)記,的同樣試劑,2)專一性化學(xué)修飾（基團(tuán)專一性修飾） 用專一性化

5、學(xué)修飾劑修飾酶活性中心的某一氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)。 3)親和標(biāo)記（位點(diǎn)專一性修飾） 采用的修飾試劑是根據(jù)底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成的含有活潑反應(yīng)基團(tuán)的底物類似物。 作用機(jī)制：利用酶對(duì)底物的特殊親和力將酶加以修飾標(biāo)記,化學(xué)修飾的專一性,Y,Y,Y,X-Y,X,親和修飾劑： 與S結(jié)構(gòu)相似，與活性中心的氨基酸殘基 親和力大，而與活性中心以外的氨基酸 殘基親和力小。 具有活潑的化學(xué)基團(tuán)（如鹵素）可與活性 中心的基團(tuán)形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵,3.蛋白質(zhì)工程： 將酶相應(yīng)的cDNA定點(diǎn)突變，突變的cDNA只表達(dá)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸被置換的酶蛋白，測(cè)定其活性可知被置換的氨基酸是否為活力所必需,第二節(jié) 酶化學(xué)修飾及修飾目的 一

6、、酶化學(xué)修飾 1.限制酶大規(guī)模應(yīng)用的原因： 1)細(xì)胞外穩(wěn)定性差； 2)酶活性不夠高； 3)具有抗原性,2. 改變酶特性有兩種主要的方法： 1)通過(guò)分子修飾的方法來(lái)改變已分離出來(lái)的天然酶的活性。 2)通過(guò)基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的,3. 酶化學(xué)修飾的概念 酶的化學(xué)修飾（chemical modification）： 通過(guò)化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，使蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。 酶選擇性化學(xué)修飾： 描述肽鏈側(cè)鏈基團(tuán)被化學(xué)試劑專一性地修飾,二、酶化學(xué)修飾的目的 1. 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（50年代末） 2. 人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用 范圍。（70年代末之后） 1）

7、提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。 3）消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能力）。 4）產(chǎn)生新的催化能力,第三節(jié) 酶化學(xué)修飾的原理 一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性 修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。 二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑 大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位,三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶 酶化學(xué)修飾后通過(guò)兩種途徑抗蛋白水解酶： 1. 大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子。“遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。 2. 酶

8、分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性,四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境 1. 酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。 破壞了抗原決定簇抗原性降低乃至消除 “遮蓋”了抗原決定簇阻礙抗原、抗體結(jié)合 2. 大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定,第四節(jié) 酶化學(xué)修飾的設(shè)計(jì) 一、充分認(rèn)識(shí)酶分子的特性 包括酶的 1. 活性部位情況 2. 穩(wěn)定條件及反應(yīng)最佳條件 3. 側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)活潑性,二、 修飾劑的選擇 要考慮 1.修飾劑的分子量及鏈的長(zhǎng)度（要求有較大的分子量） 2.修

9、飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的數(shù)目及位置（要求有較多的反應(yīng)活性基團(tuán)） 3.修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件,三、反應(yīng)條件的選擇 要注意 1. 酶與修飾劑的分子比例 2. 反應(yīng)體系的溶劑性質(zhì)、鹽濃度、pH條件 3. 反應(yīng)溫度及時(shí)間,第五節(jié) 酶化學(xué)修飾的種類及應(yīng)用 一、酶的表面化學(xué)修飾 （一）大分子修飾（大分子結(jié)合修飾） 是目前應(yīng)用最廣的酶分子修飾方法。 1.定義：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法,2. 修飾劑： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與

10、酶分子共價(jià)結(jié)合,3. 應(yīng)用： 如：PEG超氧化物歧化酶（SOD） PEG溶血類蛋白質(zhì)（鏈激酶、尿激酶等） PEG天門冬酰胺酶（ASNase） 消除了抗原性 延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期 又如：用Dextran修飾-淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白酶、過(guò)氧化氫酶，提高了酶的熱穩(wěn)定性,二）小分子修飾 （酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾） 定義：通過(guò)選擇性的試劑或親和標(biāo)記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 側(cè)鏈基團(tuán)：組成蛋白質(zhì)氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要有：氨基、羧基、胍基、巰基、酚基、咪唑基。 側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑：采用的各種小分子化合物。 20種不同氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)中只有極性氨基酸的側(cè)鏈易被修飾，它們一般具有親核性,根據(jù)

11、氨基酸側(cè)鏈R基的極性，20種氨基酸可分成4類。 1. 非極性R基氨基酸（共8種）： 丙氨酸(Alanine,Ala,A), 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 纈氨酸(Valine,Val,V), 異亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Proline,Pro,P,2.無(wú)電荷的極性R基氨基酸（共7種）： 絲氨酸(Serine,Ser,S), 蘇氨酸(Threonine,Thr,T), 酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y),

12、半胱氨酸(Cysteine,Cys,C), 天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q) 3.帶正電荷的極性R基氨基酸（共3種）： 賴氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R), 組氨酸(Histidine,His,H) 4.帶負(fù)電荷的極性R基氨基酸（共2種）： 天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D), 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E,幾種重要的修飾反應(yīng)： 烷基化反應(yīng) ?；磻?yīng) 氧化還原反應(yīng) 芳香環(huán)取代反應(yīng),1. 化學(xué)修飾反應(yīng)的類型,1) 烷基化反應(yīng)

13、試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如NH2，-SH等）發(fā)生烷基化。 可作用基團(tuán)： 氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。 修飾劑：2，4二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等,烷基化反應(yīng),2) ?；磻?yīng) 試劑特點(diǎn)： 含有 結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之?；?可作用基團(tuán)： 氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr,?；磻?yīng),3) 氧化和還原反應(yīng) 試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性。 氧化劑：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亞胺 可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán)：巰基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。 還原劑：2巰基

14、乙醇、DTT等。 可被還原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵,連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，用于保護(hù)巰基,4) 芳香環(huán)取代反應(yīng) 試劑：鹵（碘）化，硝化試劑。 碘代： I2 + HI 硝化： (NO2)4C + +(NO2)3CH,四硝基甲烷,2.特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)修飾 1) 氨基的化學(xué)修飾： 來(lái)源：Lys, Arg, His, Gln 修飾反應(yīng)：?；c烷基化 酰基化修飾劑: 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS） 烷基化修飾劑： 2，4二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亞硝酸等,2) 羧基的化學(xué)修飾 修飾羧基的反應(yīng)專一性較差。 常用水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸。可定量測(cè)

15、定酶分子中羧基的數(shù)目。 + 水溶性碳化二亞胺,3)胍基的化學(xué)修飾 來(lái)源：Arg 修飾反應(yīng)：本質(zhì)上是羰基對(duì)氨基酰基化。 修飾劑： 丁二酮 二羰基化合物 1，2環(huán)己二酮 苯乙二醛,4)巰基的化學(xué)修飾 來(lái)源：Cys 修飾反應(yīng):烷基化 修飾劑：碘乙酸(IAA) 碘乙酰胺(IAM) E-SH + R-X E-SR +HX N-乙基馬來(lái)酰亞胺（NEM）（常用的專一修飾巰基試劑） ESH,5) 二硫鍵的化學(xué)修飾 還原：巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT,氧化：過(guò)甲酸: Performic acid,6)咪唑基的化學(xué)修飾 來(lái)源：His 修飾反應(yīng):酰基化與烷基化 ?；揎梽? 常用焦碳酸二乙酯（diethyl pa

16、racarbonate） + + C2H5OH +CO2 烷基化修飾劑：碘乙酸,ICH2COOH + HI,7）酚羥基的化學(xué)修飾 來(lái)源：Tyr 修飾反應(yīng)：芳香環(huán)取代反應(yīng) 修飾劑：碘、硝化試劑（四硝基甲烷,8）吲哚基的化學(xué)修飾 來(lái)源：Trp 修飾反應(yīng)：氧化反應(yīng) 修飾劑： N-溴代琥珀酰亞胺,各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑,但解釋修飾效果須十分小心，因?yàn)椋?任何一種修飾劑不是絕對(duì)專一的。 有些修飾劑引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化失活， 不一定是活性中心基團(tuán)被共價(jià)修飾。 不同部分的相同基團(tuán)，修飾效果不同，分子內(nèi)部的必需基團(tuán)，不易被修飾,三）交聯(lián)修飾（交聯(lián)法） 用雙功能基團(tuán)試劑(如戊二醛)，與酶分子內(nèi)不同肽鏈部分共價(jià)交聯(lián)

17、，使酶分子空間構(gòu)象更加穩(wěn)定。 （四）固定化修飾（共價(jià)偶聯(lián)法） 通過(guò)酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價(jià)連接到惰性載體上，由于酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，使酶的最適pH、最適溫度和穩(wěn)定性發(fā)生改變,二、酶分子內(nèi)部修飾 （一）蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾） 蛋白主鏈修飾采用酶法（用專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶為修飾劑）。 （與前面化學(xué)修飾區(qū)別,酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種： 1 引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。 2 仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。 3 有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。 后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解,應(yīng)用實(shí)

18、例： 1）提高酶活力： 2）消除抗原性,二）氨基酸置換修飾 將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。 通過(guò)兩個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)： 化學(xué)修飾法：由于可用試劑的限制，獲得的種類少。 蛋白質(zhì)工程：利用基因操縱技術(shù)。 （三）金屬離子置換修飾 改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法,第六章 酶的蛋白質(zhì)工程 一、概念： 蛋白質(zhì)工程是以創(chuàng)造性能更適用的蛋白質(zhì)分子為目的，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)與生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，以基因重組技術(shù)為主要手段，對(duì)天然蛋白質(zhì)分子的設(shè)計(jì)和改造,二、蛋白質(zhì)的功能基礎(chǔ) 蛋白質(zhì)的功能在很大程度上取決于其空間結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定 一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定： 直接法：直接測(cè)定多肽鏈的氨基酸順序。 間接法：從編碼蛋白質(zhì)的基因的核苷酸順序來(lái)推導(dǎo)蛋白質(zhì)的氨基酸順序。 三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定： X-射線晶體衍射研究處在晶體狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu) 核磁共振(NMR)光譜研究處在溶液狀態(tài)的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),X-射線衍射技術(shù)： 用于蛋白質(zhì)