基于代謝控制育種技術(shù)選育深黃被孢霉高產(chǎn)γ-亞麻酸菌株

1、基于代謝控制育種技術(shù)選育深黃被孢霉-亞麻酸高產(chǎn)菌株郝冉，楚樂樂，胡申才*（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，武漢，430023）摘要： 為了獲得深黃被孢霉合成-亞麻酸的高產(chǎn)菌株，本研究采用了紫外照射和氮離子注入技術(shù)2種誘變方法來建立突變體庫。然后，根據(jù)-亞麻酸代謝合成途徑中的部分關(guān)鍵因子，設(shè)計并建立起了抗丙二酸和紅四氮唑(TTC)篩選模型，該2種篩選模型分別旨在提高菌體生物量和不飽和脂肪酸含量。結(jié)果顯示，采用丙二酸濃度為2 g/L的平板可篩選得到高產(chǎn)油脂菌株；在發(fā)酵培養(yǎng)的第54 h時收集菌體，用0.9 % TTC染色4 h，可作為TTC法的最佳染色條件。經(jīng)過兩輪不同方法的誘變篩選后，最終得到了一

2、株具良好遺傳穩(wěn)定性的突變株I-0281，其GLA產(chǎn)量為889.80 mg/L，比原始菌株提高了60.27%。關(guān)鍵詞: -亞麻酸；菌種選育；篩選模型；抗丙二酸法；紅四氮唑法Screening of Mortierella isabellina mutants pertain to produce high-yield -linolenic acid by metabolic control breeding techniqueHao Ran, Chu Lele, Hu Shencai* (School of Biological and Pharmaceutical Engineering, W

3、uhan Polytechnic University, Wuhan, 430023) In order to obtain Mortierella isabellina mutants with the capability of high-yielding -linolenic acid, the mutant library was constructed by UV and N+ ions implantation technique, respectively. Then, according to some key enzymes involved in the metabolic

4、 synthetic pathway of -linolenic acid, the two screening models, anti-molonic acid and triphenyltetrazolium chloride (TTC), were designed and established, which are aimed to increase biomass or contents of unsaturated fatty acid. The results showed that the high-yield strains can be screened by resi

5、stant plate containing 2 g/L molonic acid; The TTC screening model was ascertained as collecting samples after fermenting for 54 h, stained 0.9 % by TTC for 4 h. Through 2 rounds screening via the two kinds of screening model, the I-0281 mutant strain was obtained, which has good genetic stability,

6、and also the production of -linolenic acid was up to 889.80 mg/L, 60.27% higher than the wild strain. Key words: -linolenic acid; strain breeding; screening model; anti-molonic acid method; TTC method -亞麻酸（GLA）及其系列代謝物在人體的免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)中都具有重要而廣泛的生理作用1,2。GLA在食品、保健品、醫(yī)藥品、化妝品和飼料等領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越廣泛，因

7、此目前市場對GLA的需求量也越來越大。 1959年，Qsbond首次用化學(xué)合成法制備-亞麻酸，但從其原料、所用試劑以及操作條件來看，這種方法有一定難度而未得到推廣應(yīng)用。目前，商業(yè)化生產(chǎn)GLA的資源主要為植物，但自然界中富含GLA的植物資源較少，受植物來源、地域、生長季節(jié)氣候、加工生產(chǎn)成本等多因素影響，通過植物來生產(chǎn)GLA具有一定的局限性3,4。近年來發(fā)現(xiàn)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)GLA具有很大的潛力，為未來生產(chǎn)GLA的方向5。一般來說，野生菌株GLA產(chǎn)量不能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，需對菌的遺傳系統(tǒng)加以改造。囿于油脂微生物的遺傳信息不是很清楚，迄今為止還未能通過基因工程技術(shù)構(gòu)建得到能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)GL

8、A的高產(chǎn)菌株6，因此通過誘變獲得高產(chǎn)GLA菌株是目前GLA育種的首選方法7。常規(guī)的誘變育種在育種上曾取得了巨大的成就，然而其篩選工作量大、且?guī)в泻艽蟮拿つ啃浴Ｆ駷橹?，GLA的生物合成途徑和關(guān)鍵合成酶都研究得比較清楚。因此本研究主要想通過利用GLA生物合成的生物化學(xué)和遺傳學(xué)原理，在了解生物代謝途徑和代謝調(diào)節(jié)控制理論的基礎(chǔ)上8，來定向選育某種特定的突變型以使菌體生產(chǎn)性能或目的產(chǎn)物得到提高。1 材料與方法1.1 菌種 深黃被孢霉（Mortierella isabellina）AS 3.3410，購于中國科學(xué)院微生物研究所。1.2 試驗方法1.2.1 紫外誘變加5 mL生理鹽水于深黃被孢霉斜面中，用

9、接種環(huán)輕輕刮取斜面上的孢子，再過濾到離心管中可得到孢子懸液。稀釋孢子懸液至104個/mL，取孢子懸液5 mL至平板中，將其置于磁力攪拌器上，距8 W紫外燈中心30 cm處，分別照射0 s、15 s、30 s、45 s、60 s、75 s、90 s、105 s、120 s，取原液和稀釋10倍的孢子懸液100 L孢子懸液分別涂布于YPD平板，培養(yǎng)3 d并計數(shù)，作誘變致死率曲線。1.2.2 氮離子注入誘變 （1）孢子平板的制備：向AS 3.3410試管斜面中加5 mL10 %甘油，接種環(huán)輕輕刮取斜面 孢子，過濾，10 %甘油稀釋至108-1010個/mL，取100 L涂布于無菌平板中，超凈工作臺風(fēng)干

10、。 （2）離子注入：在離子注入頻率為25 HZ，靶室真空度為10-3 Pa的條件下，設(shè)置一系列不同劑量的氮離子來進行注入，對照組在離子注入時置于注入平板的下方（離子注入機為鄭州大學(xué)離子束生物工程實驗室提供）。 （3）涂布：取出平板，加2 mL生理鹽水，用橡皮塊擦洗平板底部的孢子，將平板底部的孢子洗脫，分別取稀釋倍數(shù)為100、101、102的孢子懸液100 L涂PDA平板，于28 培養(yǎng)2 d，計數(shù)并計算存活率。1.2.3 高產(chǎn)GLA菌株的篩選方法1.2.3.1 丙二酸篩選法 （1） 深黃被孢霉耐丙二酸濃度的確定試驗向冷卻至50-60 的100 mL的PDA培養(yǎng)基中分別加入500 g/L的丙二酸溶

11、液0 、0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 mL，倒平板后涂布菌液。28 培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察菌落生長狀況，確定合適的耐丙二酸篩選濃度。 （2）丙二酸篩選高產(chǎn)油脂菌株方法吸取誘變后的菌懸液涂布于含2 g/L 丙二酸的PDA平板，28 培養(yǎng)2 d。挑選菌落較大的菌株試管發(fā)酵，收集菌體，超聲波輔助提取法提取油脂，篩選油脂產(chǎn)量較高的菌株。1.2.3.2 TTC篩選法取發(fā)酵液150 L于96孔板中，加入50 L一定濃度的TTC，28 ，170 rpm搖床培養(yǎng)，再將孔板于酶標(biāo)儀中振蕩后，測492 nm處的吸光值。 （1）染色時期的確定 發(fā)酵培養(yǎng)深黃被孢霉菌株，分別測培養(yǎng)時間為41、65、89、1

12、13、137、161、185、209和233 h時的生物量、油脂含量與脂肪酸組成。分析生物量和不飽和脂肪酸含量與培養(yǎng)時間之間的關(guān)系，以確定染色時期。 （2）TTC濃度和染色時間的確定按上述TTC法，所用紅四氮唑濃度分別為為0.1 %、0.3 %、0.6 %、0.9 %和1.2 %， 28 ，170 rpm染色培養(yǎng)時間分別為0、1、2、3、4、5、6和7 h，酶標(biāo)儀振蕩30 min，吸取120 L上清液于空白孔中，測492 nm處吸光值。分別以染色培養(yǎng)時間（t）為橫坐標(biāo)，不同濃度的紅四氮唑濃度染色后A492為縱坐標(biāo)作圖。 1.2.4 氣相色譜檢測脂肪酸組成 （1）脂肪酸甲酯化：取0.3 g干菌體

13、于50 mL離心管中，加入4 mL 0.5 mol/L的KOH-CH3，60 恒溫水浴30 min，加3 mL14 % BF3-CH3OH，室溫催化5 min，加2 mL正己烷，振蕩混勻，加10 mL蒸餾水，振蕩混勻，5000 rpm離心5 min，取上層正己烷層過濾。 （2）氣相色譜分析條件：色譜柱: 安捷倫DB-WAXer毛細(xì)管柱 （60 M0.53 mm I.D. 1.5 m）；檢測器：氫火焰離子化檢測器；氣化室溫度：250 ；檢測器溫度：250 ；柱溫：程序升溫：起始溫度140 ，保持2 min，以10 /min的升溫速率上升至160 ，保持3 min，2 /min的升溫速率上升至24

14、0 ，保持3 min。 （3）進樣分析：取1 L樣品進樣。 （4）脂肪酸組成分析方法：所得氣相色譜圖對照37種脂肪酸混合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜定性分析，面積歸一化法確定各種脂肪酸所占百分比。2 結(jié)果與分析2.1 丙二酸篩選高產(chǎn)油脂深黃被孢霉菌株2.1.1 深黃被孢霉孢子紫外線誘變致死率的確定實驗 由圖1可知，紫外照射時間在 30 s 以內(nèi)時，紫外線對深黃被孢霉影響不大；當(dāng)照射時間大于30 s時，死亡率急劇增加，照射時間為75 s時，孢子死亡率已達(dá)到 90 %以上。由于致死率為70 %80 %時正突變率最高，因此，選用紫外線照射時間60 s作為紫外誘變處理時間。圖 1 深黃被孢霉紫外致死曲線2.1.2 丙二

15、酸篩選模型的建立丙二酸結(jié)構(gòu)類似于琥珀酸，競爭性抑制琥珀酸脫氫酶，因此能夠抑制三羧酸（TCA）循環(huán)。丙二酸抗性菌株，三羧酸循環(huán)途徑比較強，具有較高的能量代謝，菌體生物量應(yīng)該變大。將稀釋至一定濃度的孢子懸液涂布于一系列丙二酸濃度不同的平板，培養(yǎng)2 d，觀察菌落長勢如表1中所示，丙二酸濃度小于0.5 g/L時，對菌株沒有明顯抑制作用，當(dāng)丙二酸濃度大于2.5 g/L時，菌株生長完全被抑制，因此選用丙二酸濃度為2 g/L的平板作為誘變后高產(chǎn)油脂菌株的篩選。表 1 不同濃度的丙二酸對深黃被孢霉菌落的抑制作用丙二酸濃度（g/L）00.511.522.5菌落長勢+/-2.13 丙二酸篩選高產(chǎn)油脂深黃被孢霉菌株

16、通過2 g/L丙二酸濃度的PDA平板對紫外照射獲得的突變體庫篩選后得到了8株油脂產(chǎn)量較高的突變株，傳代培養(yǎng)5代后最終確定出U-0116、U-0218、U-0230等3個高產(chǎn)油脂菌株，其與油脂合成相關(guān)的發(fā)酵參數(shù)如表2所示。氣相色譜分析其脂肪酸組成，因發(fā)現(xiàn)其生物量和GLA產(chǎn)量均顯著高于原始菌株，因此該突變菌株U-0116將用于后續(xù)的菌種選育工作。表 2 丙二酸篩選高產(chǎn)油脂深黃被孢霉突變株編號原始出發(fā)菌株U-0116U-0218U-0230生物量/（g/L）16.7119.86179218.51油脂含量/（g/L）60706562油脂產(chǎn)量/（g/L）10.0313.9011.6511.48油脂產(chǎn)量提

17、高率38.58 %16.15 %14.46 %GLA產(chǎn)量/（mg/L）554.14699.7633.74632.392.2 TTC法篩選高產(chǎn)GLA菌株2.2.1 TTC染色時期的確定圖2 生物量和單位菌體內(nèi)不飽和脂肪酸含量隨發(fā)酵培養(yǎng)時間變化曲線 由圖2可知，在發(fā)酵前4 d，生物量增加迅速，在46 d生物量增加明顯減緩，在發(fā)酵7 d后，生物量基本不再增加，當(dāng)發(fā)酵時間大于10 d，由于發(fā)酵液營養(yǎng)物質(zhì)的利用和有害代謝產(chǎn)物的積累，生物量有下降趨勢。從單位菌體不飽和脂肪酸隨培養(yǎng)時間變化趨勢來看，選擇前7 d測較為合適。綜合以上兩點，為提高篩選效率以及準(zhǔn)確性，選擇第5 d進行染色。2.2.2 TTC染色濃

18、度和染色時間的確定發(fā)酵培養(yǎng)至第5 d時，采用不同濃度TTC染色，A492隨時間變化曲線如圖3所示。由圖3可知，0.9 % TTC在7 h內(nèi)染色效果均強于用0.1 %、0.3 %、0.6 %、1.2 %TTC的染色效果。這說明TTC濃度過高或過低均不利于染色，在低濃度TTC條件下，分子之間的碰撞幾率降低而降低染色速度，過高濃度TTC可能對細(xì)胞產(chǎn)生毒性而影響了脫氫酶活性。用0.9 %的TTC染色，在前4 h內(nèi)，A492隨染色時間延長增加非常迅速，染色時間大于4 h時，A492隨時間變化趨于平緩。因此，選擇0.9 %的TTC染色4 h可作為染色的最佳條件。圖3 不同TTC濃度染色后A492隨時間變化

19、情況2.2.3 氮離子注入誘變條件的確定由圖4可知，致死率隨注入劑量的增大呈現(xiàn)先增大后減小再增大的趨勢，這與多人報道的離子注入誘變曲線呈“馬鞍型”相一致10,11。在上面的 6種誘變劑量中各隨機挑選出 25株，發(fā)酵測其GLA產(chǎn)量，統(tǒng)計誘變率，與U-0116對比GLA產(chǎn)量增加5 % 作為正突變計算，結(jié)果見表3，由表3可知，注入劑量為481014 ions/cm2時，正突變率達(dá)到最大，為36 %。在離子注入劑量誘變曲線上的峰值范圍內(nèi)可以獲得較高的正突變率，這與余增亮，孟小琴等12的研究結(jié)果相一致，因此選擇離子注入劑量為481014 ions/cm2。表3 不同N+注入劑量下的正突變率注入劑量/（1

20、014ions/cm2）612244872致死率7591947297正突變率1216243616圖4 N+離子注入誘變曲線2.2.4 TTC法篩選高產(chǎn)不飽和脂肪酸深黃被孢霉菌株通過氮離子注入（能量30 KeV，頻率25 Hz，注入劑量481014 ions/cm2）菌株U-0116，經(jīng)PDA平板分離共獲得78株菌，采用TTC法從中篩選獲得了9株脫氫酶活性較高的突變菌株，其脫氫酶活性如表4所示，特別是突變株I0274、I0281、I0291和I0314均較U-0116菌株提高了約20%以上。表4 TTC法篩選的各高產(chǎn)不飽和脂肪酸突變菌株的吸光值菌株編號U-0116I-0274I-0281I-02

21、87I-0292I-0295I-0305I-0306I-0313I-0314A4920.15020.19060.17930.16300.19700.16550.17330.17110.17120.18042.2.5 氣相色譜法復(fù)篩高產(chǎn)GLA深黃被孢霉菌株氣相分析這9株脫氫酶活性較高的菌株，結(jié)果如表5。由表5可知，這9株脫氫酶活性較高的菌株其不飽和脂肪酸組成均高于原始菌株，其中菌株I-0281、I-0314的GLA/TFA分別為6.700 %、6.509 %，比次出發(fā)菌株U-0116分別提高了24.51 %、20.99 %。而突變株I-0281具有良好的遺傳穩(wěn)定性，其GLA產(chǎn)量為889.80 m

22、g/L，比原始菌株提高了60.27%。表5 深黃被孢霉各突變株菌體所含的不飽和脂肪酸與GLA占總脂肪酸含量菌株編號U-0116I-0274I-0281I-0287I-0292I-0295I-0305I-0306I-0313I-0314UFA/TFA（%）68.30170.83271.17871.77973.36572.33971.74771.90573.04372.093GLA/TFA(%)5.3816.0896.7006.0164.9845.4215.5695.7175.3906.5093 討論 GLA是一種多不飽和脂肪酸，生物合成機制比較復(fù)雜，從葡萄糖起始合成涉及20多步酶促反應(yīng)。要想菌體

23、內(nèi)大量產(chǎn)生GLA，關(guān)鍵在于能否打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，因此應(yīng)從增強目的產(chǎn)物的主代謝流，切斷支路代謝，解除菌體自身的反饋調(diào)節(jié)，增加前體物的合成及去除終產(chǎn)物等幾個方面入手。通過誘變技術(shù)得到突變菌株，有些突變菌株可能發(fā)生了上述幾種情況的變異，如何篩選得到不同特質(zhì)的突變株，本研究著力于采用代謝控制育種技術(shù)來進行理性選育，以減少盲目性和提高目的性。本研究的研究思路一是從提高菌體內(nèi)總體油脂含量入手，二是增強脂肪酸脫氫酶的脫氫能力。油脂是細(xì)胞內(nèi)積累產(chǎn)物，生物量增大，有可能單位發(fā)酵體積內(nèi)菌體的油脂量就增多。丙二酸作為呼吸抑制劑，在本實驗中發(fā)現(xiàn)丙二酸抗性菌株中的油脂總含量比原始菌株有大幅度提高，這應(yīng)該與其有利

24、于菌體生長相關(guān)13。TTC法篩選目標(biāo)主要是找到脂肪酸脫氫酶活力提高的菌株，因此應(yīng)盡量減少除脂肪酸脫氫酶和蘋果酸脫氫酶以外的其它脫氫酶的干擾。TTC染色應(yīng)選在生物量增長緩慢區(qū)：一是可以減少篩選大量菌株時，因加樣時間不同，菌體量變化而引起的測量誤差；二是可以減少在代謝旺盛時期其他脫氫酶如丙酮酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶等的干擾。本論文研究采用了不同誘變方法和篩選方法得到了U-0116等多株產(chǎn)量高于原始菌株30%以上的突變株，這些突變株分別具有生物量高、油脂合成量高或GLA合成能力強等不同特點?；蚪M改組（genome-shuffling）技術(shù)是近年來被開發(fā)應(yīng)用于菌種改良非常成功的一種育種

25、技術(shù)14，而上述獲得的各突變株為我們下一步采用基因組改組技術(shù)來獲得集成各突變株優(yōu)點于一身的高產(chǎn)優(yōu)良菌株提供了親本菌株，有望為獲得更高產(chǎn)的菌株奠定堅實基礎(chǔ)。參考文獻1 周同永, 任飛, 鄧?yán)? 等. -亞麻酸及其生理生化功能研究進展J. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(3): 53-582 喬冬，龐永昌，李揚.-亞麻酸對小鼠免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用J.食品科學(xué)，2011, 32 (21) : 247-2523 慕鴻雁，裘愛泳.-亞麻酸生理功能、資源及其分離純化J.糧食與油脂，2004, (10):12-144 李會珍,張志軍.植物合成長鏈多不飽和脂肪酸研究進展J.中國生物工程雜志，2008, 28(12): 112-1155 李忠玲, 岳淑寧, 王衛(wèi)衛(wèi), 趙文娟, 任平, 徐霞美. 絲狀真菌發(fā)酵生產(chǎn)-亞麻酸的研究進展J. 微生物學(xué)雜志, 2008, 28: 94-976 CHEN R, SHINZO T, KEISUKE M, et al . Prod