病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷參考PPT

1、1,病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷,王 躍臨床微免教研室,2,什么是病毒,病毒（virus）是一類體積微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、有嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生性的非細(xì)胞型微生物,3,特點(diǎn)： 體積微小，只能在電鏡下觀察，能通過濾菌器 無完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)衣殼核酸核心 只有一種類型核酸：RNA或DNA 有嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生性，只能在活細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng) 以核酸復(fù)制的方式增殖，不能進(jìn)行二分裂繁殖 抵抗力特殊：耐冷不耐熱，對(duì)化學(xué)因素的抵抗力較一般比細(xì)菌強(qiáng)，耐甘油，對(duì)抗生素及磺胺類藥物不敏感，干擾素可抑制病毒復(fù)制,4,病毒感染的實(shí)驗(yàn)診斷方法,病原學(xué)診斷 病毒分離培養(yǎng) 顯微鏡檢查 抗原檢測(cè) 核酸檢測(cè) 血清學(xué)診斷 抗體檢測(cè) IgM、IgG,5,一

2、、標(biāo)本采集、運(yùn)送和處理,一）標(biāo)本采集 采集時(shí)間：盡早采集（越早越好） 標(biāo)本種類：根據(jù)感染的部位、可能感染的病毒類型選擇標(biāo)本種類 無菌采集標(biāo)本：必要時(shí)用抗生素或抗真菌藥處理 抑制細(xì)菌生長(zhǎng) 100U/ml青霉素100g/ml鏈霉素 抑制真菌生長(zhǎng) 2.5g/ml二性霉素B 或40 g/ml制霉菌素 血清學(xué)檢查標(biāo)本：雙份血清,6,二）標(biāo)本的運(yùn)送與保存,1.低溫送檢 4可保存數(shù)小時(shí)，-70可長(zhǎng)期保存 -10 -20下病毒易滅活，不可用于保存病毒標(biāo)本 對(duì)冷凍標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融 2.保濕送檢 50%甘油鹽水保存送檢 病毒轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基（virus transport medium ，VTM）含0.5%明膠或牛血

3、清白蛋白的Hanks液 3.無菌送檢 抑制細(xì)菌生長(zhǎng) 100U/ml青霉素100g/ml鏈霉素 抑制真菌生長(zhǎng) 2.5g/ml二性霉素B 或40 g/ml制霉菌素,7,二、病毒的形態(tài)學(xué)檢查,1. 光學(xué)顯微鏡檢查 主要觀察病變組織中的包涵體，某些大病毒也通過光學(xué)顯微鏡觀察。 簡(jiǎn)便、快速，但敏感性低，有些病毒感染細(xì)胞后不形成包涵體,8,2. 電鏡及免疫電鏡檢查,直接檢查標(biāo)本中的病毒顆粒，快速，可確診。但敏感性低（106/ml） 免疫電鏡敏感性高，但只能用于已知病毒的檢測(cè),乙型肝炎病毒電鏡圖,輪狀病毒電鏡圖,9,三、病毒的分離與鑒定,10,一）病毒的分離,組織培養(yǎng) 雞胚培養(yǎng) 動(dòng)物接種,11,1. 組織培

4、養(yǎng),將人或動(dòng)物離體的活組織或分散的活細(xì)胞在體外人工控制的條件下使其生長(zhǎng)繁殖的一種技術(shù)。 組織培養(yǎng)的類型: （1）組織塊培養(yǎng) （2）器官培養(yǎng) 人胚氣管呼吸道病毒； 人胚腸 腸道病毒 （3）細(xì)胞培養(yǎng) 最常用 原代和次代細(xì)胞培養(yǎng) 二倍體細(xì)胞培養(yǎng) 傳代細(xì)胞培養(yǎng),12,動(dòng)物新鮮組織（人胚腎等）胰酶消化營養(yǎng)液培養(yǎng)單層細(xì)胞（原代細(xì)胞） 原代細(xì)胞胰酶消化轉(zhuǎn)種培養(yǎng)（次代培養(yǎng)細(xì)胞） 對(duì)病毒敏感，但制備費(fèi)時(shí)費(fèi)力，只能傳23代,原代和次代培養(yǎng)細(xì)胞,13,二倍體細(xì)胞株 原代細(xì)胞反復(fù)傳代（5070代）仍保持二倍體染色體特性。病毒分離和疫苗制備的首選細(xì)胞株。 傳代細(xì)胞株 來源于腫瘤細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞，能在體外無限增殖。

5、增殖快，不易衰老，易于傳代保存。常用于病毒的分離鑒定，但不能用于制備疫苗,14,優(yōu)點(diǎn) 細(xì)胞來源廣、敏感細(xì)胞株多 不受機(jī)體免疫因素的影響，個(gè)體差異小 病變結(jié)果易于觀察 可用于病毒的分離鑒定和制備疫苗及抗原 缺點(diǎn) 條件要求相對(duì)較高，有細(xì)胞培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)室才能做,15,2. 雞胚培養(yǎng),新鮮受精卵 接種病毒,3839 713d,卵黃囊接種（流行性腦炎病毒） 羊膜腔接種（流感病毒） 尿囊腔接種（傳代培養(yǎng)） 絨毛尿囊膜接種（痘類病毒,16,絨毛尿囊膜表現(xiàn)有痘病毒的特異性損傷,17,優(yōu)點(diǎn) 雞胚來源充足，操作簡(jiǎn)便，有多種接種途徑 病毒增殖快，可收獲大量病毒 雞胚本身是無菌的，對(duì)接種的病毒不產(chǎn)生抗體 缺點(diǎn) 易感

6、病毒少，目前主要用于流感病毒、腮腺炎病毒、皰疹病毒和痘類病毒的分離培養(yǎng)。 某些病毒在雞胚內(nèi)傳代后，其毒力下降,18,3. 動(dòng)物接種,常用動(dòng)物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒對(duì)動(dòng)物的敏感性不同，根據(jù)病毒種類加以選擇。 接種途徑 按病毒侵襲部位選擇相應(yīng)的接種途徑： 乙型腦炎病毒及狂犬病毒 小鼠腦內(nèi)接種 柯薩奇病毒 乳鼠腹腔接種 乙肝病毒 黑猩猩靜脈注射 流感病毒 鼻腔滴種 用途 分離鑒定病毒，制備疫苗，制備抗血清,19,優(yōu)點(diǎn) 方法簡(jiǎn)單、結(jié)果易于觀察 選擇適當(dāng)?shù)慕臃N途徑，可出現(xiàn)類似人類的感染癥狀，有利于發(fā)病機(jī)制的研究 缺點(diǎn) 可自然帶毒或隱性感染，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果 有個(gè)體差異 很多病毒無敏感動(dòng)

7、物，或感染后不出現(xiàn)明顯癥狀,20,二）病毒的鑒定,病毒的初步鑒定 動(dòng)物感染：敏感動(dòng)物范圍、潛伏期及發(fā)病情況 雞胚接種：病毒對(duì)雞胚的敏感性、特殊病灶（如痘皰等） 細(xì)胞培養(yǎng)：病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn) 理化性質(zhì)的測(cè)定：主要用于新病毒的鑒定 病毒的最后鑒定 血清學(xué)鑒定: 中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)等。 分離的新病毒，必須進(jìn)行系統(tǒng)的全面鑒定,21,病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn),1. 細(xì)胞代謝作用改變（培養(yǎng)液顏色變化） 正常細(xì)胞代謝： 培養(yǎng)液由紅變黃 病毒增殖，抑制細(xì)胞代謝：培養(yǎng)液顏色不變或更紅,22,病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后，使宿主細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生不同程度改變，稱為細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effe

8、ct，CPE,2. 細(xì)胞形態(tài)改變,細(xì)胞變圓、融合、腫脹、細(xì)胞空泡、核濃縮、形成嗜酸性或嗜堿性包涵體等。 某些病毒感染細(xì)胞后不出現(xiàn)CPE,23,24,25,26,3. 干擾現(xiàn)象（interference） 當(dāng)兩種不同的病毒同時(shí)或先后感染同一細(xì)胞時(shí)，其中一種病毒可抑制另一種病毒的增殖，稱為病毒的干擾現(xiàn)象。 干擾現(xiàn)象也可被相應(yīng)特異性抗體抑制，稱為干擾抑制現(xiàn)象,27,4. 紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗(yàn),受感染的宿主細(xì)胞膜含病毒抗原（血凝素），可吸附雞、豚鼠或猴紅細(xì)胞。 如果在培養(yǎng)瓶中加入相應(yīng)的血凝素抗血清，則不出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，即紅細(xì)胞吸附抑制試驗(yàn)陽性,28,病毒的理化性質(zhì)測(cè)定,主要用于新病毒的鑒定 1

9、. 病毒的大小及形態(tài) ：電鏡直接觀察及測(cè)量 2. 核酸類型: 用RNA酶或DNA酶處理病毒。 3. 乙醚敏感試驗(yàn): 有包膜病毒對(duì)乙醚敏感，經(jīng)乙醚作用后，失去感染性 4. 耐酸試驗(yàn) 腸道病毒耐酸，在pH3的環(huán)境下穩(wěn)定，鼻病毒不耐酸，在pH3的環(huán)境下被滅活,29,病毒的血清學(xué)鑒定,對(duì)初步鑒定為陽性的標(biāo)本均需要用血清學(xué)方法做最后鑒定。 方法：血凝抑制試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)、ELISA等,30,四、病毒的血清學(xué)診斷,用已知病毒抗原檢測(cè)患者血清中的相應(yīng)抗體，可協(xié)助診斷病毒感染。 雙份血清IgG測(cè)定 4倍以上增長(zhǎng)，有診斷意義 單份血清IgM測(cè)定 可用于早期診斷，但部分病人可能陰性，少數(shù)病人產(chǎn)生的特異

10、性IgM抗體也可在體內(nèi)持續(xù)存在12年,31,病毒血清學(xué)試驗(yàn)常用方法,一）中和試驗(yàn) 原理 抗體與相應(yīng)病毒結(jié)合后，能夠使病毒失去感染性。 V.Ab 失去感染易感細(xì)胞的能力 一定量抗體可中和一定量病毒 根據(jù)抗體的效價(jià)對(duì)待測(cè)病毒液進(jìn)行半定量檢測(cè)。 中和試驗(yàn)的必要條件： 1. 活病毒 2. 敏感細(xì)胞、雞胚或動(dòng)物,32,中和試驗(yàn)的特點(diǎn)： 特異、敏感，既可檢測(cè)抗體，也可測(cè)定抗原（定屬、定型）。 既可用細(xì)胞培養(yǎng)做，也可用動(dòng)物或雞胚接種，以細(xì)胞培養(yǎng)法最常用。 檢測(cè)IgG，不能用于早期診斷，常用于流行病學(xué)調(diào)查,33,二）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn),檢測(cè)IgM，常用于早期診斷。 不需活細(xì)胞，比中和試驗(yàn)簡(jiǎn)單，省時(shí)。 （三）IF及ELISA 方法簡(jiǎn)單、快速、敏感性高。 檢測(cè)特異性IgM，有助于某些病毒感染的早期診斷，如： 孕婦羊水中檢測(cè)IgM型特異抗體：胎兒先天性感染 抗HBc IgM：作為急性HBV感染的指標(biāo),34,四）血凝及血凝抑制試驗(yàn),含有血凝素的病毒能吸附一定種類的哺乳動(dòng)物或禽類的紅細(xì)胞，使紅細(xì)胞凝集。該現(xiàn)象可被相應(yīng)的血凝素抗體抑制，稱為血凝抑制試驗(yàn)，可用于病毒的分型,35,五、病毒抗原檢查,DFA、IFA、IEA等。 可檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)、外