流式細(xì)胞術(shù)的原理

1、流式細(xì)胞術(shù)的原理,概念 Definition,流式細(xì)胞術(shù) Flow cytometry (FCM) 特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析 檢測的對象主要是各種生物顆粒，包括大量的臨床樣本：外周血，骨髓，細(xì)胞穿刺液，洗脫液，實(shí)體組織，同時(shí)包括各種各樣的科研研究對象：培養(yǎng)細(xì)胞，藻類、染色體、原生動物 cell suspension 細(xì)胞懸液在流動的狀態(tài)中被檢測各項(xiàng)特性,流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu) 以及原理,流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu) 以及工作原理,雖然每款流式細(xì)胞儀有各自的特征性結(jié)構(gòu)，但是其內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本組成相同。 基本結(jié)構(gòu)一共分三部分： 液流系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng) 電子系統(tǒng),液流系統(tǒng),液流系統(tǒng)包括 流動室

2、flow chamber 液流驅(qū)動系統(tǒng),鞘液三大作用： 避免堵塞噴孔 約束樣本位于噴嘴中心、提高測量精度 保持細(xì)胞活性,液流系統(tǒng),對靈敏度要求不是很苛刻的實(shí)驗(yàn)，可調(diào)高樣本進(jìn)樣速率，從而提高采樣分析速度,光學(xué)系統(tǒng),主要由激發(fā)光源、光束成形及收集系統(tǒng)組成,弧光燈： 氙燈、高壓汞燈價(jià)格便宜 激發(fā)光譜廣 但是 單色性差-單一譜線上能量弱 穩(wěn)定性差-功率不穩(wěn)定 激光器： 氣體激光器：氬離子（488nm）、氦氖（633nm）、氪離子（647nm）、氪氬（568nm） 半導(dǎo)體激光器：價(jià)格低、結(jié)構(gòu)簡單、使用壽命長。BD FACSCalibur采用的635nm 染料激光器,光學(xué)系統(tǒng),激光器： 單波長、高能量、發(fā)

3、散角小、高穩(wěn)定性光照,光學(xué)系統(tǒng),激光在檢測細(xì)胞樣本前經(jīng)過透鏡聚焦成為非常窄的高能量光束。 激光光束的橫截面呈橢圓形光斑，所以除了集聚能量（細(xì)胞通過檢測區(qū)時(shí)就可以得到很強(qiáng)的信號），這樣還可以避免照射到其他細(xì)胞造成干擾,激光光束成形-透鏡聚焦,光學(xué)系統(tǒng),收集系統(tǒng),如何將混合的熒光區(qū)分開來，分別進(jìn)行收集呢？ 濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍,光學(xué)系統(tǒng),電子系統(tǒng),流式細(xì)胞儀的工作原理,散射光信號,前向角散射光（FSC，F(xiàn)orward Scatter）： 細(xì)胞相對大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC，Side Scatter）： 細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞核相對復(fù)雜性,散射光信號,熒光信號,特異

4、熒光信號,背景信號,熒光素,什么是熒光及熒光素？ 某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光波長長的光線-即熒光。而這些受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱為熒光素。 什么是熒光發(fā)生機(jī)理？ 室溫下的熒光素分子大部分處于穩(wěn)定的“基態(tài)”。當(dāng)熒光素在激發(fā)光的照射下吸收足夠的光能后，躍遷到新的狀態(tài)，即“激發(fā)態(tài)”。處于激發(fā)態(tài)的熒光分子極不穩(wěn)定，它可以通過極短時(shí)間（納秒）內(nèi)以發(fā)射一定波長的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。 這一過程稱為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光,熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜,所有的熒光素都有兩個(gè)特征光譜。 激發(fā)光譜（Excitation，Ex）： -是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波

5、長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。 -我們一般標(biāo)注的是吸收波峰，也就是最大吸收波長：Ex-Max 發(fā)射光譜（Emission，Em）： -是指熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光。所有熒光都是寬譜發(fā)射。 -一般標(biāo)注的是發(fā)射波峰，即最大發(fā)射波長：Em-Max,FITC的激發(fā)與發(fā)射光譜,常用染料FITC可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：525nm，可以配用530/30接收通道,488nm,525nm,PI的激發(fā)與發(fā)射光譜,常用染料PI同樣可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：625nm，所以配用不同的585/42接收通道,488nm,625nm,APC的激發(fā)與發(fā)射光譜,常用染料APC可被633nm激

6、光激發(fā)，Em-Max：660nm，可以配用660/20接收通道,633nm,660nm,熒光染料的選擇,儀器配置： 激光器種類； 光信號接收通道； 減少發(fā)射光光譜重疊,補(bǔ)償,熒光染料寬譜發(fā)射的特征產(chǎn)生補(bǔ)償問題,PE滲漏到FITC通道的信號 FL1-x%FL2,FITC滲漏到PE通道的信號 FL2-x%FL1,先電壓，后補(bǔ)償,雙色染色的實(shí)驗(yàn)中 先使用陰性管調(diào)電壓陰性對照（1）：細(xì)胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE 然后用單染管調(diào)補(bǔ)償單染管（2）：細(xì)胞+抗體A FITC or 抗體B PE,調(diào)電壓 -尋找目標(biāo)細(xì)胞群; -多色實(shí)驗(yàn)中，分出陰陽性細(xì)胞群分界線 調(diào)閾值 -減少背景信號 調(diào)補(bǔ)償 -減

7、去干擾信號,調(diào)節(jié)電壓、閾值、補(bǔ)償,調(diào)整熒光接收器電壓,電壓改變對數(shù)據(jù)顯示的影響,數(shù)據(jù)存儲,List Mode列表模式：每個(gè)細(xì)胞的參數(shù)依次按順序排列存儲,FITC/PE 雙染樣本,數(shù)據(jù)顯示,二維點(diǎn)圖 （Dot Plot） 直方圖（Histogram） 等高線圖 （Contour Plot） 密度圖 （Density） 三維圖（3D Plot）等,樣本收集及處理,制備單細(xì)胞懸液,免疫熒光染色,表型測定,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,流式細(xì)胞術(shù)操作流程,1.樣本制備,樣本來源,血液 骨髓 淋巴結(jié) 體液 （尿液、腦脊液、胸腹腔積液） 灌洗液（肺泡支氣管） 加抗凝劑（EDTA），室溫保存，24h內(nèi) 實(shí)體組織 機(jī)械法制備單

8、細(xì)胞懸液，保持抗原活性，不宜用酶、表面活性劑,2.免疫熒光染色,染色方式的選擇,直接染色 標(biāo)有熒光染料的抗體直接特異結(jié)合目標(biāo)抗原。 首選的方式：方便快捷、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確、非特異結(jié)合少 間接染色 標(biāo)有熒光染料的二抗間接特異結(jié)合目標(biāo)抗原。 在直接染色不能實(shí)現(xiàn)的情況下，選用的方式： 非特異性結(jié)合相對增加。在流式試劑日益全面的情況下，越來越少的客戶選擇這種方式。僅適用于研究最新發(fā)現(xiàn)抗原的客戶,熒光染料的選擇,1，首先，了解目標(biāo)抗原 1）細(xì)胞表面抗原 2）細(xì)胞內(nèi)或是核內(nèi)抗原（固定、透膜步驟） 3）以上兩者兼?zhèn)洹Ｏ葮?biāo)記表面抗原，固定后，破膜標(biāo)記胞內(nèi)抗原。 4）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的測定。使用細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑，如

9、monensin、BFA，使得細(xì)胞因子不能分泌到細(xì)胞外。（活化、固定、透膜） 2，了解熒光染料及其工作原理，做出準(zhǔn)確的選擇,熒光染料的種類,熒光染料分為 三大類,1. 小分子化合物： FITC、Pacific Blue,2. 大分子熒光 蛋白：AmCyan， PerCP，PE, APC,3. 串聯(lián)染料： PerCP-Cy5.5， PE-Cy5,如何正確選擇與使用熒光素,儀器配置：有哪些激光器與接收通道 多色實(shí)驗(yàn)中，盡量減少熒光素之間的相互干擾 如APC與Cy5不能串聯(lián)使用，兩者光譜重疊大，補(bǔ)償不好調(diào)。 盡量選擇應(yīng)用廣、亮度高的熒光素 熒光素的強(qiáng)弱用Stain Index染色指數(shù)來表示，數(shù)值越大，信噪比越高。 多色實(shí)驗(yàn)中，亮度高的熒光素搭配表達(dá)量低的目標(biāo)抗原 例如，PE， APC這類大分子蛋白相對亮度高。 關(guān)注F/P比值 尤其是使用小分子熒光素，一個(gè)抗體上會標(biāo)記多個(gè)熒光素分子。 在細(xì)胞本身自發(fā)熒光強(qiáng)的情況下，使用發(fā)射光波長大于600nm的熒光染料。 避免使用串聯(lián)染料，不穩(wěn)定，可能發(fā)生降解,BD網(wǎng)站提供每一種熒光素的激發(fā)以及發(fā)射光譜,常用的熒光素組合,臨床應(yīng)用,HIV診斷與治療 白血病和淋巴瘤的免疫分型