多糖中十六烷基三甲基溴化銨含量的測(cè)定方法

1、.多糖中CTAB含量的測(cè)定方法【說(shuō)明書(shū)】：技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及測(cè)試分析領(lǐng)域，具體地涉及一種利用高校液相色譜測(cè)定腦膜炎球菌多糖中CTAB含量的方法。背景技術(shù)CTAB，全稱(chēng)為十六烷基三甲基溴化銨，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在多糖純化過(guò)程中，CTAB作為螯合劑使復(fù)合糖得以沉淀。然而CTAB具有一定的刺激性，可因吸入、咽下或皮膚吸收而使人體受到危害。近年來(lái)，在生物制品申報(bào)過(guò)程中，國(guó)家規(guī)定應(yīng)明確CTAB等有機(jī)物質(zhì)殘留量以降低制品風(fēng)險(xiǎn)。因此準(zhǔn)確測(cè)定腦膜炎多糖原液中CTAB的殘留量對(duì)疫苗生產(chǎn)有著重要影響，對(duì)疫苗產(chǎn)品質(zhì)量控制具有重要的意義。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道腦膜炎球菌多糖原液及腦膜

2、炎球菌多糖疫苗中CTAB殘留量的測(cè)定方法，因此如何對(duì)腦膜炎球菌多糖疫苗中的CTAB進(jìn)行檢測(cè)尚不確定。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種快速而準(zhǔn)確的腦膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的測(cè)定方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，提供的測(cè)定方法包括以下步驟：取CTAB標(biāo)準(zhǔn)溶液和腦膜炎球菌多糖溶液樣品，分別上樣于高效凝膠色譜柱，根據(jù)色譜圖計(jì)算腦膜炎球菌多糖溶液樣品中CTAB的濃度。具體地，包括以下步驟：（1）制取CTAB標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣1，其濃度標(biāo)記為C1；（2）取待檢的腦膜炎球菌多糖溶液，作為樣2；（3）樣1、樣2分別上樣于高效凝膠色譜柱；（4）記錄色譜圖并進(jìn)行積分計(jì)算；（5）根據(jù)公式計(jì)算樣2中CTAB的濃度。其中，凝膠色

3、譜柱為T(mén)SKgelG5000色譜柱。其原理是根據(jù)樣品分子大小不同進(jìn)行分離，CTAB與肺炎多糖分子大小間存在差異，可被有效分離。其中，流動(dòng)相為（0.8-0.9%）NaCl溶液。其中，上樣體積分別為20-100l；洗脫流速為0.4-0.6ml/min。其中，在檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm下記錄色譜圖。其中，所述腦膜炎球菌為A群腦膜炎球菌、C群腦膜炎球菌、Y群腦膜炎球菌、W135群腦膜炎球菌中的任意一種。其中，根據(jù)色譜圖進(jìn)行積分計(jì)算，利用以下公式計(jì)算腦膜炎球菌多糖溶液樣品中CTAB的濃度：將CTAB標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣1，其濃度標(biāo)記為C1；將待檢的腦膜炎球菌多糖溶液樣品，作為樣2；根據(jù)公式（）計(jì)算樣2中CTAB的

4、濃度：C2=（S2S1）C1，其中，S2為樣2對(duì)應(yīng)的峰面積，S1為樣1對(duì)應(yīng)的峰面積；根據(jù)公式（）計(jì)算樣2中CTAB的百分含量：F=（C2C0）100%，其中，C0為待檢腦膜炎球菌多糖溶液樣品中的多糖濃度。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，檢測(cè)腦膜炎球菌多糖中CTAB含量的具體步驟為：（1）精密制取CTAB標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣1，其濃度標(biāo)記為C1；（2）取待檢的腦膜炎球菌多糖溶液，作為樣2；（3）充分平衡色譜柱后，將樣1上樣于凝膠色譜柱進(jìn)行洗脫，記錄色譜圖：洗脫峰開(kāi)始所對(duì)應(yīng)時(shí)間標(biāo)記為t1，洗脫峰結(jié)束所對(duì)應(yīng)時(shí)間標(biāo)記為t2；（4）對(duì)樣1色譜圖進(jìn)行積分，積分窗口為從t1到t2，得到樣1對(duì)應(yīng)的峰面積為S1；（5）將樣

5、2上樣于高效凝膠色譜柱進(jìn)行洗脫；（6）對(duì)樣2色譜圖進(jìn)行積分，積分窗口為從t1到t2，得到樣2對(duì)應(yīng)的峰面積為S2；（7）根據(jù)公式（）：C2=（S2S1）C1（）計(jì)算樣2中CTAB的濃度；（8）測(cè)定待檢腦膜炎球菌多糖溶液中的多糖濃度，標(biāo)記為C0；（9）根據(jù)公式（）：F=（C2C0）100%（）計(jì)算樣2中CTAB的百分含量。本發(fā)明根據(jù)CTAB分子與腦膜炎多糖分子間大小存在差異，利用二者在凝膠層析時(shí)的保留時(shí)間不同，采用高效液相色譜法將CTAB與腦膜炎球菌多糖分離，利用已知濃度的CTAB作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，從而準(zhǔn)確測(cè)定腦膜炎球菌多糖原液中CTAB含量。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供了一種準(zhǔn)確、重復(fù)性好、快速、

6、便捷的腦膜炎球菌多糖原液中CTAB含量的測(cè)定方法，當(dāng)CTAB濃度在6.25-100g/ml時(shí)，線性相關(guān)系數(shù)r大于0.9990，變異系數(shù)CV小于3%，平均回收率在98%以上，從而建立了評(píng)價(jià)腦膜炎球菌多糖原液質(zhì)量的新方法。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1檢測(cè)方法的考察1.1線性關(guān)系考察精密稱(chēng)取CTAB10mg，用0.85%NaCl溶解并定容至10ml，作為對(duì)照品貯備液（濃度為1mg/ml）。精密

7、吸取CTAB對(duì)照品貯備液10ml，定容至100ml容量瓶，作為對(duì)照品工作液（濃度為100g/ml）。將對(duì)照品工作液依次稀釋至濃度100g/ml、50g/ml、25g/ml、12.5g/ml、6.25g/ml，吸取不同濃度的對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣20l，記錄色譜圖。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液X（g/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得其回歸方程。結(jié)果見(jiàn)表1。表1線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果線性方程R值Y1=32446X1+33572R1=0.9991Y2=29931X2+105550R2=0.9990Y3=31349X3-94998R3=0.9995結(jié)果表明，峰面積與濃度之間線性關(guān)系良好。1.2檢測(cè)限與定量

8、限以信噪比為3倍時(shí)（樣品主峰高約為基線噪音的3倍）的溶液濃度作為樣品的檢出限，以信噪比為10倍時(shí)的溶液濃度作為樣品的定量限，計(jì)算結(jié)果得CTAB的檢測(cè)限為0.06g/ml，定量限為0.20g/ml。1.3精密度試驗(yàn)取濃度為6.25g/ml的CTAB對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄其峰面積，并計(jì)算其變異系數(shù)CV（%），結(jié)果見(jiàn)表2。表2含量重復(fù)性測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，此方法的精密性良好。1.4準(zhǔn)確度試驗(yàn)以Y群原液做稀釋液，配制CTAB濃度100g/ml，進(jìn)樣20l，平行操作2次，記錄色譜圖。以100g/mlCTAB作為對(duì)照品，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。表3Y群原液回收率結(jié)論：當(dāng)CTAB濃度在6.25-1

9、00g/ml時(shí)，該方法線性相關(guān)系數(shù)r大于0.9990，變異系數(shù)CV小于3%，平均回收率在98%以上。本檢測(cè)方法適用于腦膜炎多糖原液中CTAB含量的檢測(cè)，具有良好的線性、精密度及準(zhǔn)確度。實(shí)施例2A群腦膜炎球菌中CTAB含量的測(cè)定精密制取100g/ml（C1）CTAB標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣1；取待檢的A群腦膜炎球菌多糖溶液，加標(biāo)CTAB濃度為100g/ml，作為樣2；將樣1上樣于充分平衡的高效凝膠色譜柱TSKgelG5000色譜柱，上樣體積為20l，0.9%NaCl溶液洗脫，洗脫流速為0.5ml/min，于波長(zhǎng)214nm記錄色譜圖：洗脫峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間為21.450min，峰結(jié)束對(duì)應(yīng)時(shí)間為24.492min

10、。對(duì)樣1色譜圖進(jìn)行積分，調(diào)節(jié)積分窗口為從峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間21.450min到峰結(jié)束對(duì)應(yīng)時(shí)間24.492min，得到樣1對(duì)應(yīng)的峰面積為3289049；將樣2上樣于充分平衡的高效凝膠色譜柱，上樣體積為20l，洗脫流速為0.5ml/min，于波長(zhǎng)214nm記錄色譜圖；對(duì)樣2色譜圖進(jìn)行積分，調(diào)節(jié)積分窗口為從峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間21.450min到峰結(jié)束對(duì)應(yīng)時(shí)間24.492min，得到樣2對(duì)應(yīng)的峰面積為3230746根據(jù)公式（1）計(jì)算A群腦膜炎球菌多糖CTAB的濃度C2=（S2S1）C1=（32307463289049）100=98.23g/ml；測(cè)定待檢A群腦膜炎球菌多糖的糖濃度為9.8mg/ml（C0）；根

11、據(jù)公式（2）計(jì)算A群腦膜炎球菌多糖CTAB的百分含量F=（C2C0）100%=（98.23/9800）100%=1.00%。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)測(cè)得樣品回收率為98.23%。實(shí)施例3C群腦膜炎球菌中CTAB含量的測(cè)定精密制取100g/ml（C1）CTAB標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣1；取待檢的C群腦膜炎球菌多糖溶液，作為樣2；將樣1上樣于充分平衡的高效凝膠色譜柱，上樣體積為20l，0.8%NaCl溶液洗脫，洗脫流速為0.4ml/min，于波長(zhǎng)214nm記錄色譜圖：洗脫峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間為26.397min，峰結(jié)束對(duì)應(yīng)時(shí)間為29.499min。對(duì)樣1色譜圖進(jìn)行積分，調(diào)節(jié)積分窗口為從峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間26.397min到峰結(jié)束對(duì)

12、應(yīng)時(shí)間29.499min，得到樣1對(duì)應(yīng)的峰面積為3240747；將樣2上樣于充分平衡的高效凝膠色譜柱，上樣體積為20l，洗脫流速為0.4ml/min，于波長(zhǎng)214nm記錄色譜圖；對(duì)樣2色譜圖進(jìn)行積分，調(diào)節(jié)積分窗口為從峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間26.397min到峰結(jié)束對(duì)應(yīng)時(shí)間29.499min，得到樣2對(duì)應(yīng)的峰面積為6976；根據(jù)公式（1）計(jì)算C群腦膜炎球菌多糖CTAB的濃度C2=（S2S1）C1=（69763240747）100=0.22g/ml；測(cè)定待檢C群腦膜炎球菌多糖的糖濃度為10.3mg/ml（C0）；根據(jù)公式（2）計(jì)算C群腦膜炎球菌多糖CTAB的百分含量F=（C2C0）100%=（0.22/1

13、0300）100%=0.0021%。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)測(cè)得樣品回收率為98.12%。實(shí)施例4Y群腦膜炎球菌中CTAB含量的測(cè)定精密制取100g/ml（C1）CTAB標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣1；取待檢的Y群腦膜炎球菌多糖溶液，作為樣2；將樣1上樣于充分平衡的高效凝膠色譜柱，上樣體積為20l，0.85%NaCl溶液洗脫，洗脫流速為0.6ml/min，于波長(zhǎng)214nm記錄色譜圖：洗脫峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間為17.382min，峰結(jié)束對(duì)應(yīng)時(shí)間為20.489min。對(duì)樣1色譜圖進(jìn)行積分，調(diào)節(jié)積分窗口為從峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間17.382min到峰結(jié)束對(duì)應(yīng)時(shí)間20.489min，得到樣1對(duì)應(yīng)的峰面積為3301241；將樣2上樣于充分平衡的

14、高效凝膠色譜柱，上樣體積為20l，洗脫流速為0.6ml/min，于波長(zhǎng)214nm記錄色譜圖；對(duì)樣2色譜圖進(jìn)行積分，調(diào)節(jié)積分窗口為從峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間17.382min到峰結(jié)束對(duì)應(yīng)時(shí)間20.489min，得到樣2對(duì)應(yīng)的峰面積為5158；根據(jù)公式（1）計(jì)算Y群腦膜炎球菌多糖CTAB的濃度C2=（S2S1）C1=（51583301241）100=0.16g/ml；測(cè)定待檢Y群腦膜炎球菌多糖的糖濃度為10.5mg/ml（C0）；根據(jù)公式（2）計(jì)算Y群腦膜炎球菌多糖CTAB的百分含量F=（C2C0）100%=（0.16/10500）100%=0.0015%通過(guò)該實(shí)驗(yàn)測(cè)得樣品回收率為98.36%。實(shí)施例5W1

15、35群腦膜炎球菌中CTAB含量的測(cè)定精密制取100g/ml（C1）CTAB標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣1；取待檢的W135群腦膜炎球菌多糖溶液，作為樣2；將樣1上樣于充分平衡的高效凝膠色譜柱，上樣體積為100l，0.85%NaCl溶液洗脫，洗脫流速為0.5ml/min，于波長(zhǎng)214nm記錄色譜圖：洗脫峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間為21.315min，峰結(jié)束對(duì)應(yīng)時(shí)間為24.427min。對(duì)樣1色譜圖進(jìn)行積分，調(diào)節(jié)積分窗口為從峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間21.315min到峰結(jié)束對(duì)應(yīng)時(shí)間24.427min，得到樣1對(duì)應(yīng)的峰面積為3321734；將樣2上樣于充分平衡的高效凝膠色譜柱，上樣體積為100l，洗脫流速為0.5ml/min，于波長(zhǎng)214nm記錄色譜圖；對(duì)樣2色譜圖進(jìn)行積分，調(diào)節(jié)積分窗口為從峰開(kāi)始對(duì)應(yīng)時(shí)間21.315min到峰結(jié)束對(duì)應(yīng)時(shí)間24.427min，得到樣2對(duì)應(yīng)的峰面積為7825；根據(jù)公式（1）計(jì)算W135群腦膜炎球菌多糖CTAB的濃度C2=（S2S1）C1=（3912516608670）100=