單克隆抗體制備流程

1、單抗制備流程 1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)上的突破不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)基礎(chǔ)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。制備單克隆抗體包括動物免疫、細(xì)胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn)，要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序，逐一介紹其實驗方法。一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備(一)免疫方案選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要。一般要在融合前兩個

2、月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定。1.顆粒性抗原免疫性較強(qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:初次免疫1100.5ml ip (腹腔內(nèi)注射)23周后第二次免疫1100.5ml ip3周后加強(qiáng)免疫(融合前三天)1100.5ml ip或iv(靜脈內(nèi)注射)取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴(kuò)散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。初次免疫 Ag150g加福氏

3、完全佐劑皮下多點注射(一般0.81ml0.2ml點)3周后第二次免疫劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip(ip劑量不宜超過0.5ml)3周后第三次免疫劑量同上，不加佐劑，ip (57天后采血測其效價，檢測免疫效果)23周后加強(qiáng)免疫，劑量50500g為宜，ip或iv3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原(特別是一些弱抗原)的免疫方案也不斷有所更新，如將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強(qiáng)了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。改變抗原注入的途徑，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。使用細(xì)胞因子作為佐劑，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平，促進(jìn)免疫細(xì)胞對抗原反應(yīng)性。(二)飼養(yǎng)細(xì)胞在制備單克隆抗體過程中，許多環(huán)節(jié)需要

4、加飼養(yǎng)細(xì)胞，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(較為常用)、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞，也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存，隨用隨復(fù)蘇。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLbc小鼠610周齡拉頸處死浸泡于75酒精，消毒35分鐘用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜用無菌注射器注入68ml培養(yǎng)液反復(fù)沖洗，吸出沖洗液放入10ml離心管，1200轉(zhuǎn)分離心56分鐘用20小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)液混懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)110ml加入96孔板

5、，100l孔放入37CO2孵箱培養(yǎng)一般飼養(yǎng)細(xì)胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得58106腹腔巨噬細(xì)胞，若用小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞時，細(xì)胞濃度為5106ml，小鼠脾細(xì)胞為1106ml，小鼠的成纖維細(xì)胞(3T3)1105ml，均為100l孔。(三)骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞系應(yīng)和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細(xì)胞在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAb。常用骨髓瘤細(xì)胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653等。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)適合于一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在1020，細(xì)胞的最大密度不得超10ml，一般擴(kuò)大培養(yǎng)以110稀釋傳代，每3

6、5天傳代一次。細(xì)胞的倍增時間為1620小時，上述三株骨髓瘤細(xì)胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細(xì)胞。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞，為確保該細(xì)胞對HAT的敏感性，每36月應(yīng)用8AG(8氮雜鳥嘌呤)篩選一次，以防止細(xì)胞的突變。保證骨髓瘤細(xì)胞處于對數(shù)生長期，良好的形態(tài)，活細(xì)胞計數(shù)高于95，也是決定細(xì)胞融合的關(guān)鍵。(四)免疫脾細(xì)胞免疫脾細(xì)胞指的是處于免疫狀態(tài)脾臟中B淋巴母細(xì)胞棗漿母細(xì)胞。一般取最后一次加強(qiáng)免疫3天以后的脾臟，制備成細(xì)胞懸液，由于此時B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合的成功率較高。脾細(xì)胞懸液的制備：在無菌條件下取出脾臟，用不完全的培養(yǎng)液洗一次，置平皿中不銹鋼

7、篩網(wǎng)上，用注射器針芯研磨成細(xì)胞懸液后計數(shù)。一般免疫后脾臟體積約是正常鼠脾臟體積的倍，細(xì)胞數(shù)為10左右。二、細(xì)胞融合，選擇雜交瘤(一)細(xì)胞融合流程(1)取對數(shù)生長的骨髓瘤細(xì)胞SP20，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用不完全培養(yǎng)液混懸細(xì)胞后計數(shù)，取所需的細(xì)胞數(shù)，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。(2)同時制備免疫脾細(xì)胞懸液，用不完全培養(yǎng)液洗滌2次。(3)將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按110或15的比例混合在一起，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1200rpm,8分鐘。(4)棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。(5)輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動。(6)在室溫下融合:30秒內(nèi)加入預(yù)

8、熱的1ml45PEG(Merek,分子量4000)含5DMSO，邊加邊攪拌。作用90秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120秒鐘。加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔分鐘分別加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。(7)離心，800rpm，6分鐘。(8)棄上清，先用6ml左右20小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。(9)根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補加完全培養(yǎng)液，10ml一塊96孔板。(10) 將融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，100l孔，37、5CO2孵箱培養(yǎng)。一般一塊96孔板含有1107脾細(xì)胞。(二)HAT選擇雜交瘤應(yīng)用

9、HAT 選擇培養(yǎng)液篩選雜交瘤細(xì)胞的原理已在研究生專題講座第六專題中已經(jīng)提到，這里主要介紹加HAT選擇培養(yǎng)的時間和濃度。一般在融合24小時后，加HAT選擇培養(yǎng)液。HT和HAT均有商品化試劑50貯存，用時1ml加入50ml20小牛血清完全培養(yǎng)液中。因為在培養(yǎng)板內(nèi)已加入飼養(yǎng)細(xì)胞、融合后的細(xì)胞，200l孔。所以在加選擇培養(yǎng)液時應(yīng)加3倍量的HAT。我們認(rèn)為，融合后最初補加的量可用全量的23進(jìn)行選擇，可得到滿意的篩選結(jié)果。50HATH:510-3MA:210-5MT:810-4M一般選擇HAT選擇培養(yǎng)液維持培養(yǎng)兩周后，改用HT培養(yǎng)液，再維持培養(yǎng)兩周，改用一般培養(yǎng)液。三、抗體的檢測篩選雜交瘤細(xì)胞通過選擇性培

10、養(yǎng)而獲得雜交細(xì)胞系中，僅少數(shù)能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底110面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系。檢測抗體的方法應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。常用的方法有:1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白質(zhì))、細(xì)胞和病毒等McAb的檢測。2.RIA用于可溶性抗原、細(xì)胞McAb的檢測。3.FACS(熒光激活細(xì)胞分類儀)用于檢查細(xì)胞表面抗原的McAb檢測。4.IFA用于細(xì)胞和病毒McAb的檢測。上述方法均為一般實驗室的常規(guī)方法，故在此不介紹具體的實驗過程。可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方

11、法不當(dāng)貽誤整個篩選時機(jī)。四、雜交瘤的克隆化和凍存克隆化一般是指將抗體陽性孔進(jìn)行克隆化。犚r為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內(nèi)只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞；所需要的抗體(特異性抗體)分泌細(xì)胞和其它無關(guān)抗體分泌細(xì)胞。要想將這些細(xì)胞彼此分開，就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應(yīng)盡早進(jìn)行克隆化，否則抗體分泌的細(xì)胞會被抗體非分泌的細(xì)胞所抑制，因為抗體非分泌細(xì)胞的生長速度比抗體分泌的細(xì)胞生長速度快，二者競爭的結(jié)果會使抗體分泌的細(xì)胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細(xì)胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細(xì)胞的突變或染色體

12、丟失，從而喪失產(chǎn)生抗體的能力。(一)克隆化方案用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。1.有限稀釋法的程序制備飼養(yǎng)細(xì)胞懸液(同融合前準(zhǔn)備)陽性孔細(xì)胞的計數(shù)，并調(diào)細(xì)胞數(shù)在1510ml取130個細(xì)胞放入6.5ml含飼養(yǎng)細(xì)胞完全培養(yǎng)液，即20個細(xì)胞ml，100l孔加A、B、C三排為每孔2個細(xì)胞。余下2.9ml細(xì)胞懸液補加2.9ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液,細(xì)胞數(shù)為10個ml，100l孔加D、E、F三排，為每孔1個細(xì)胞。余下2.2ml細(xì)胞懸液補加2.2ml含飼養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)5個ml，100l孔，加G、H兩排，為每孔0.5個細(xì)胞。培養(yǎng)45天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細(xì)胞克隆，

13、補加完全培養(yǎng)液200l孔。第89天時，肉眼可見細(xì)胞克隆，及時進(jìn)行抗體檢測。注:初次克隆化的雜交瘤細(xì)胞需要在完全培養(yǎng)液中加HT。2.軟瓊脂法軟瓊脂的配制含20FCS(小牛血清)的2倍濃縮的RPMI16401瓊脂水溶液：高壓滅菌，42預(yù)熱。0.5瓊脂：由1份1瓊脂加1份含20小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42保溫。用上述0.5瓊脂液(含有飼養(yǎng)細(xì)胞)15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。按100ml，500ml或5000ml等濃度配制需克隆的細(xì)胞懸液。1ml 0.5瓊脂液(42預(yù)熱)在室溫中分別與1ml不同濃度的細(xì)胞懸液相混合?；靹蚝罅⒓磧A注于瓊脂基底

14、層上，在室溫中10分鐘，使其凝固，孵育于37，5CO2孵箱中。45天后即可見針尖大小白色克隆，710天后，直接移種至含飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。檢測抗體，擴(kuò)大培養(yǎng)，必要時再克隆化。(二)雜交瘤細(xì)胞的凍存及時凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞、每次克隆化得到的亞克隆細(xì)胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞系的時候，細(xì)胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細(xì)胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細(xì)胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。雜交瘤細(xì)胞的凍存方法同其他細(xì)胞系的凍存方法一樣，原則上細(xì)胞應(yīng)在每支安瓿含1106以上，但對原始孔的雜交瘤細(xì)胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)長滿孔

15、底時，一孔就可以凍一支安瓿。細(xì)胞凍存液:50小牛血清40不完全培養(yǎng)液10DMSO(二甲亞砜)凍存液最好預(yù)冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0，再降溫時一般按每分鐘降溫23，待降至-70可放入液氮中?；蚣?xì)胞管降至0 后放-70超低溫冰箱，次日轉(zhuǎn)入液氮中。也可以用細(xì)胞凍存裝置進(jìn)行凍存。凍存細(xì)胞要定期復(fù)蘇，檢查細(xì)胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細(xì)胞可保存數(shù)年或更長時間。五、單克隆抗體的大量生產(chǎn)大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法主要有兩種：1.體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)管大量培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產(chǎn)量低，一般培養(yǎng)液含量為1060gml，如果大量生產(chǎn)，費用較高。2.體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)

16、胞，制備腹水或血清。實體瘤法對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞按13107ml接種于小鼠背部皮下，每處注射0.2 ml, 共24點。待腫瘤達(dá)到一定大小后(一般1020天)則可采血，從血清中獲得單克隆抗體含量可達(dá)到1-10mgml。但采血量有限。腹水的制備常規(guī)是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液體石臘于BaLbc鼠，12周后腹腔注射1106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞710天后可產(chǎn)生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水征象，待腹水盡可能多，而小鼠頻于死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一只小鼠可獲110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水中單克隆抗體含量可達(dá)5-20mg/

17、ml， 這是目前最常用的方法，還可將腹水中細(xì)胞凍存起來，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)種小鼠腹腔則產(chǎn)生腹水快、量多。六、單克隆抗體的鑒定對制備的McAb進(jìn)行系統(tǒng)的鑒定是十分必要的。應(yīng)對其做如下方面的鑒定:1.抗體特異性的鑒定：除用免疫原(抗原)進(jìn)行抗體的檢測外，還應(yīng)用與其抗原成分相關(guān)的其它抗原進(jìn)行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如制備抗黑色素瘤細(xì)胞的McAb，除用黑色素瘤細(xì)胞反應(yīng)外，還應(yīng)用其它臟器的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞進(jìn)行交叉反應(yīng)，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體。制備抗重組的細(xì)胞因子的單克隆抗體，應(yīng)首先考慮是否與表達(dá)菌株的蛋白有交叉反應(yīng)，其次是與其它細(xì)胞因子間有無交叉。2.McAb的Ig類與亞

18、類的鑒定：一般在用酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行篩選時，已經(jīng)基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標(biāo)或熒光素標(biāo)記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至于亞類則需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)作雙擴(kuò)或夾心ELISA來確定McAb的亞類。在作雙擴(kuò)試驗時，如加入適量的PEG(3)，將有利于沉淀線的形成。3.McAb中和活性的鑒定：用動物的或細(xì)胞的保護(hù)實驗來確定McAb的生物學(xué)活性。例如如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種于易感的動物或敏感的細(xì)胞，來觀察動物或細(xì)胞是否得到抗體的保護(hù)。4.McAb識別抗原表位的鑒定：用競爭結(jié)合試驗、測相加指數(shù)的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。5.McAb親和力的鑒定：用ELISA或RIA競爭結(jié)合試驗來確定McAb與相應(yīng)抗原結(jié)合的親和力。七、影響因素、失敗原因分析由于制備McAb的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。其主要失敗原因和影響因素有:1.污染：包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是雜交瘤工作中最辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支