酶循環(huán)法及其在酶法分析中的應(yīng)[專業(yè)研究]

1、酶循環(huán)法及其在酶法分析中的應(yīng)用楊昌國，許葉（寧波市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，浙江寧波315010）關(guān)鍵詞：酶法分析；酶循環(huán)法中圖分類號：R461.1 文獻標(biāo)識碼：A由于酶法測定的特異性好，檢測簡便，反應(yīng)溫和，無污染，且靈敏度較高(10100umol/L)，已能滿足體液中大部分物質(zhì)的測定，因此在臨床化學(xué)測定中已廣為應(yīng)用。隨著臨床化學(xué)的發(fā)展，體液中某些微量物質(zhì)的準(zhǔn)確測定逐漸顯得重要。酶循環(huán)法是利用酶的底物特異性來放大靶物質(zhì)（被測物）的測定方法。此法僅循環(huán)靶物質(zhì)，減少了樣品中存在的其它物質(zhì)對測定的干擾，因此不需要對樣品進行預(yù)處理或隊靶物質(zhì)的提取，而且該法不需要專門的設(shè)備，是一種前景廣闊的測定技術(shù)。日本旭化成（

2、Asahi Chemical）公司發(fā)展了這一技術(shù)，筆者參考旭化成公司的有關(guān)資料，將這一技術(shù)介紹給國內(nèi)的同行。1 酶循環(huán)法的原理物質(zhì)A在酶a和底物a(Sa)的存在下轉(zhuǎn)化為物質(zhì)B，同時生成產(chǎn)物a(Pa)；這物質(zhì)B又在酶b(Eb)和底物b(Sb)的存在下轉(zhuǎn)化為物質(zhì)A，同時生成產(chǎn)物b(Pb)。上述反應(yīng)每循環(huán)一次，將消耗與物質(zhì)A等量的Sa和Sb，同時生成等當(dāng)量的Pa和Pb。因此在一定時間內(nèi)，循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)亦就是Sa和Sb消耗或Pa和Pb生成相當(dāng)于物質(zhì)A(或物質(zhì)B)的倍數(shù)，通過檢測Sa或Sb的減少或Pa或Pb的生成就可以提供檢測物質(zhì)A(或物質(zhì)B)的n倍靈敏度。見圖1。 底物a(Sa) 產(chǎn)物a(Pa) Ka

3、循環(huán)Kb 酶a(Ea) 物質(zhì)A 物質(zhì)B 酶b(Eb)產(chǎn)物b(Pb) 底物b(Sb)圖1 酶循環(huán)法原理1.1 條件1.1.1 物質(zhì)A和B的濃度與酶a和酶b對底物Sa和Sb的Km值相比較，應(yīng)相當(dāng)小，即A或BKmSa(或KmSa)。1.1.2 酶a和酶b對底物Sa和Sb的Km值應(yīng)相當(dāng)小，對底物應(yīng)有高親和力。1.2 原理 米氏方程 vVS/( S+Km)，vKS，(KV/Km)。當(dāng)t0、A=A0、B=0時，AB A0；當(dāng)t0并假設(shè)反應(yīng)已達到平衡狀態(tài)，那么，Ea的速度是VbKbA。Eb的速度是VbKbB。在平衡狀態(tài)時，vavb因此，A:B=Kb:Ka。循環(huán)反應(yīng)速度vcvavb(固定的)，假設(shè)vcKcA0

4、(Kc=循環(huán)速率常數(shù))，那么從KcKaKb/(Ka+Kb)推導(dǎo)，如果Ka+Kb常數(shù)，當(dāng)KaKb時，Kc是最大的。1.3 測定靈敏度 。2 酶循環(huán)反應(yīng)的靈敏度可通過產(chǎn)物的循環(huán)常數(shù)(Kc)和反應(yīng)時間(t)來確定；Kc又可通過兩種酶的量來確定；酶量又取決于酶的特異活性和Km值，循環(huán)反應(yīng)是在相同的條件(如溫度、離子強度等)下進行，兩種酶的反應(yīng)常數(shù)亦相同(由于Va/Kma=Vb/Kmb，因此KcKaKb)。既然循環(huán)反應(yīng)的靈敏度可通過Kct(min)來確定，故可用調(diào)整加入酶量或反應(yīng)時間來隨意控制。選擇Km小的酶，用較小的酶就能得到較高的靈敏度。3 循環(huán)反應(yīng)的類型按反應(yīng)中使用的酶可分四種類型：3.1 方法A

5、 底物循環(huán)，氧化酶和脫氫酶系統(tǒng)。氧化酶對靶物質(zhì)氧化，脫氫酶又把氧化態(tài)的靶物質(zhì)轉(zhuǎn)化成還原態(tài)。靶物質(zhì)和它的氧化產(chǎn)物作為底物被循環(huán)，速率可達50300次/分。舉例：溶血卵磷脂(lysolrcithin)(又稱溶血磷脂酰膽堿，lysophosphatidyl choline)，是磷脂的一種，它隨氧化型LDL和VLDL水平增高而增高，后兩者已確認與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。測定原理見圖2。預(yù)處理反應(yīng)：測定反應(yīng)：(1) (2) DAOS4-AAP(3)DAOS （比色測定） O2 H2O2 醌亞胺 循環(huán) GPO G3P DHAP G3PDH NAD NADH 12-HSD 膽堿 酮類膽酸GO：甘油氧化

6、酶 LYPL：溶血磷脂酶GPC：甘油磷脂酰膽堿 GPCP：磷酸二酯酶G3P：3磷酸甘油 GPO：甘油磷酸氧化酶DHAP：磷酸二羥丙酮 G3PDH：3磷酸甘油脫氫酶12-HSD：12-羥類固醇脫氫酶 DAOS：N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧苯胺圖2 溶血卵磷脂酶循環(huán)法原理3.2 方法B 底物循環(huán)，脫氫酶和輔酶系統(tǒng)。靶物質(zhì)和它的氧化產(chǎn)物作為底物被循環(huán)，僅用一種酶和兩種輔酶(巰基NAD和NADH)。在410nm測定巰基NADH的增高速率，循環(huán)速率約100次/分。舉例：膽汁酸測定，原理見圖3。 巰基-NAD 巰基-NADH(415nm測定) 循環(huán) 3-HSD 膽汁酸 酮類膽汁酸

7、 3-HSD NAD NADH 3-HSD：3-羥類固醇脫氫酶 圖3 膽汁酸酶循環(huán)法測定原理3.3 方法C 輔酶循環(huán)，雙脫氫酶系統(tǒng)。靶物質(zhì)被轉(zhuǎn)化為輔酶(NAD)，使用兩種脫氫酶使NAD-NADH間循環(huán)。本系統(tǒng)靈敏度很高，循環(huán)速率至少可達1000次/分。舉例：NH3測定，原理見圖4。 NH3 三磷酸腺苷脫氨-NAD 單磷酸腺苷PPi D-葡萄糖 NAD 甲月簪染料(比色測定) 葡萄糖 脫氫酶 循環(huán) 黃遞酶 D-葡萄糖酸-內(nèi)酯 NADH 四唑鹽 圖4 NH3 酶循環(huán)法測定原理利用這一反應(yīng)原理，增加前反應(yīng)亦可測定尿素和肌酐。尿素前反應(yīng)：肌酐前反應(yīng)：3.4 方法D 氨循環(huán)，NAD合成酶-脫氫酶系統(tǒng)。靶

8、物質(zhì)NH3被轉(zhuǎn)化成NAD，再通過亮氨酸脫氫酶使L-亮氨酸轉(zhuǎn)變成氧化異己酸和NH4+，NH4+又重復(fù)反應(yīng)，原理見圖5。 ATP AMP+PPi NAD合成酶 NH4+脫氨-NAD NAD+ Mg2+ 亮氨酸 亮氨酸脫氫酶 NH4+氧化異乙酸 NADH4 酶循環(huán)法的特征和應(yīng)用前景傳統(tǒng)的酶反應(yīng)只能按靶物質(zhì)的量生成相應(yīng)的產(chǎn)物量，而酶循環(huán)法則可在一定的反應(yīng)時間內(nèi)通過靶物質(zhì)的重復(fù)反應(yīng)來增加產(chǎn)物的量。因此，可通過延長反應(yīng)時間和/或增加酶的用量來加速循環(huán)以增加循環(huán)次數(shù)(循環(huán)速率)來提高靈敏度。選擇用高循環(huán)速率的酶和合適的循環(huán)方法可使循環(huán)速率達到501000次/分。另外通過使用酶的特殊底物(如巰基-NAD)可簡化反應(yīng)體系，亦可偶聯(lián)呈色反應(yīng)(如四氮唑染料或Trinder反應(yīng))使其成為可見光譜測定。本法還可與熒光和發(fā)光分析結(jié)合使靈敏度更高。由于本法是一個比色測定，它可能被用作EIA檢測方法，消除測定污染的存在。5 酶循環(huán)法推廣應(yīng)用尚需克服的難題 由于酶循環(huán)法具有諸多優(yōu)越性，是一種有前途的測定方法，但目前要推廣使用尚有一些問題需要解決：因此法工具酶的用量是普通酶法的10到數(shù)1