基因表達載體的構(gòu)建ppt課件

1、基因表達載體的構(gòu)建,基因工程基本操作的四個步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,1、基因表達載體的構(gòu)建目的,基因表達載體的構(gòu)建基因工程的核心,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并且可以遺傳給后代 使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用,2、基因表達載體的組成,目的基因,標記基因,啟動子,終止子,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶的結(jié)合位點，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄 標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來

2、,用_切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)切口，露出_。 用_切斷目 的基因，使其產(chǎn)生_ _,3、基因表達載體的構(gòu)建過程,將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的_處， 再加入_，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒,限制酶,黏性末端,同種限制酶,的黏性末端,切口,DNA連接酶,相同,載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶：既用到限制酶切割目的基因和載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵 啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少 目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進

3、去,注意,限制酶的選擇：一種限制酶切割結(jié)果分析,思考討論,使用EcoR一種限制酶切割外源DNA和質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達載體時，可以形成哪些連接產(chǎn)物,下圖箭頭表示EcoR的酶切位點，EcoR識別序列及切點為GAATTC,質(zhì)粒自身環(huán)化；含目的基因的源DNA自身環(huán)化； 質(zhì)粒和含目的基因的外源外DNA反向連接； 質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA正向連接,難 點 突 破,EcoR,限制酶的選擇： EcoR切割結(jié)果分析,GAATTC CTTAAG,GAATTC CTTAAG,目的基因,AATTC G,G CTTAA,G,A,A,T,T,C,C,T,A,A,G,T,1,1,2,2,1和1連接,2和2連接,自身環(huán)化,

4、相互連接,1和2連接， 1 和2連接,1和2連接，1 和2連接,正向,反向,限制酶的選擇：兩種限制酶切割結(jié)果分析,思考討論,選用EcoR和Hind 兩種限制酶切割外源DNA和質(zhì)粒，可以形成哪些連接產(chǎn)物,下圖箭頭表示兩種限制酶的酶切位點，EcoR和Hind識別序列及切點分別為GAATTC，AAGCTT,質(zhì)粒和含目的基因的外源DNA正向連接,難 點 突 破,限制酶的選擇：EcoR和Hind切割結(jié)果分析,GAATTC CTTAAG,AAGCTT TTCGAA,目的基因,AATTC G,A TTCGA,1,1,2,2,正向連接：1和2連接， 1 和2連接,EcoR,Hind,EcoR,Hind,例1、

5、【2012年江蘇第32題】圖1表示含有目的基因D的DNA片段長度（bp即堿基對）和部分堿基序列，圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列?，F(xiàn)有Msp、BamH、Mbo、Sma4種限制性核酸內(nèi)切酶切割的堿基序列和酶切位點分別為CCGG、GGATCC、GATC、CCCGGG。請回答下列問題,若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過同種限制酶處理后進行，形成重組質(zhì)粒，那么應(yīng)選用的限制酶是 。在導入重組質(zhì)粒后，為了篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，一般需要用添加 的培養(yǎng)基進行培養(yǎng),BamH,抗生素B,例2、【2016年江蘇高考33題】下表是幾種限制酶識別序列及其切割位點，圖1、圖2中標注了相關(guān)限制酶的酶切位點，其中切割位點相同的酶不重復標注。請回答下列問題,1）用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，應(yīng)選用 兩種限制酶切割,Bcl和Hind,2）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加,四環(huán)素,例3、【2019年江蘇33題】下圖是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因（tetr)和氨芐青霉素抗性基因（ampr,為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的菌落，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加,氨芐青霉素,添加氨芐青霉素的培養(yǎng)基,平板影印培養(yǎng)法,基因表達載體的構(gòu)建概念圖,基因表達載體的構(gòu)建,使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給下一代，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用,基因表達載體的組成,目的