月季的花藥培養(yǎng)

1、月季的花藥培養(yǎng),花的結(jié)構(gòu)：花梗、花托、萼片、花瓣、雌蕊和雄蕊,2、花藥的結(jié)構(gòu),雄蕊,花粉是花粉母細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂而形成的，因此，花粉是單倍體的生殖細(xì)胞,被子植物的花粉發(fā)育,花粉粒的形成,經(jīng)歷時(shí)期,四分體時(shí)期、單核期、雙核期,兩個(gè)精子和一個(gè)營(yíng)養(yǎng)核的基因型相同,花粉粒類(lèi)型,一個(gè)成熟的花粉粒即為雄配子體，有兩種情況,二核花粉粒:成熟的花粉粒中，只含花粉管細(xì)胞核和生殖細(xì)胞核。（精子在花粉管中形成,三核花粉粒:有些植物的花粉，在成熟前，生殖細(xì)胞進(jìn)行一次有絲分裂，形成兩個(gè)精子，這樣的花粉在成熟時(shí)，含有一個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和兩個(gè)精子。兩個(gè)精子和一個(gè)營(yíng)養(yǎng)核的基因型相同,花粉,胚狀體,愈傷組織,從芽,生根,移栽,脫分化,

2、分化,再分化,誘導(dǎo),產(chǎn)生花粉植株的兩條途徑,花粉,從芽,人工種子,又稱(chēng)人造種子、合成種子或無(wú)性種子，就是將組織培養(yǎng)所產(chǎn)生的體細(xì)胞胚、不定芽、頂芽、腋芽或小鱗莖等繁殖體，包裹在能提供營(yíng)養(yǎng)的膠囊（人造胚乳）里，再在外面包上一層具有保護(hù)功能和防止機(jī)械損傷的外膜（人造種皮），造成一種類(lèi)似種子的結(jié)構(gòu)，能在一定的條件下萌發(fā)生長(zhǎng)，形成完整植株,不同植物 同一植物的不同生理狀況 （花期早期初花期） 合適的花粉發(fā)育期 （單核居中期與靠邊期之間） 此外，植株生長(zhǎng)條件、材料低溫預(yù)處理、 接種密度等,三）影響花藥培養(yǎng)的因素,1. 材料的選擇,為什么花瓣松動(dòng)會(huì)給材料的消毒帶來(lái)困難,答：花瓣松動(dòng)后，微生物就可能侵入到花藥

3、，給材料的消毒帶來(lái)困難,2. 培養(yǎng)基的組成,月季花藥培養(yǎng)基配方,實(shí)驗(yàn)操作,結(jié)果分析與評(píng)價(jià),一）材料的選取 染色鏡檢 （二）材料的消毒 酒精、氯化汞、次氯酸鈣 （三）接種和培養(yǎng),MS培養(yǎng)基配方中添加GA、IBA和BA，質(zhì)量濃度分別為0.1mg/L、 0.5mg/L和1mg/L,誘導(dǎo)叢芽或胚狀體的培養(yǎng)基配方,MS培養(yǎng)基各成分用量減半，添加IAA，質(zhì)量濃度為1mg/L,誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基配方,一）材料的選取,選擇花藥時(shí)，一般通過(guò)鏡檢來(lái)確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。 最常用的方法有醋酸洋紅法。但是，某些植物的花粉細(xì)胞核不易著色，需采用焙花青-鉻礬法，這種方法能將花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色,醋酸洋紅法染色

4、機(jī)理,醋酸洋紅為堿性染色劑，而花粉細(xì)胞內(nèi)有染色體，染色體主要成分是DNA和蛋白質(zhì),易被堿性染料著色染成紅色,將體積分?jǐn)?shù)45的醋酸100ml煮沸，緩緩加入1g洋紅，在加熱回流8h，冷卻至50，過(guò)濾即可,醋酸洋紅的配置,2、醋酸洋紅法,將花藥放在載玻片上，加一滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)1的醋酸洋紅，用鑷柄將花藥搗碎，蓋上蓋玻片在顯微鏡下檢查,染色操作,3、焙花青鉻釩法,將無(wú)水酒精與冰醋酸按體積比為3：1的比例混勻,卡諾氏固定液的配制方法,花藥應(yīng)該在卡諾氏固定液中固定20min，然后取出放在載玻片上，加焙花青鉻釩溶液染色，蓋上蓋玻片后在顯微鏡下檢查,將5g鉻明礬K2SO4Cr2(SO4)24H2O加入90ml蒸餾水

5、中，溶解后加入0.1g焙花青，混勻并加熱至沸騰，煮沸5分鐘后冷卻至室溫，過(guò)濾，加蒸餾水定容至100ml,焙花青鉻釩溶液的配制方法,染色操作,二）材料的消毒,1. 花蕾用V/V為70%的酒精浸泡30秒 2. 無(wú)菌水清洗 3. 無(wú)菌吸水紙吸干花蕾表面的水分 4. 放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中 24分鐘（也可質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯 酸鈣溶液或飽和漂白粉溶液,5. 無(wú)菌水沖洗35次 用于培養(yǎng)花藥，實(shí)際上多數(shù)未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或穎片保護(hù)，通常處于無(wú)菌狀態(tài)，所以只要將整個(gè)花蕾或幼穗消毒即可,三）接種和培養(yǎng),滅菌后花蕾，要在無(wú)菌條件下除去萼片和花瓣，并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上。在剝離花藥時(shí)

6、，要盡量不損傷花藥（否則接種后，容易從受傷部位產(chǎn)生二倍體的愈傷組織），同時(shí)還要徹底去除花絲，因?yàn)榕c花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成,通常每瓶接種花藥7-10個(gè)，溫度控制在25左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。 一般經(jīng)過(guò)20-30天培養(yǎng)后，會(huì)發(fā)現(xiàn)花藥開(kāi)裂，長(zhǎng)出愈傷組織或釋放出胚狀體。將愈傷組織及時(shí)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分化出再生植株,如果花藥開(kāi)裂釋放出胚狀體，則一個(gè)花藥內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開(kāi)裂后盡快將幼小植株分開(kāi)，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開(kāi)。 在花藥培養(yǎng)中，特別是通過(guò)愈傷組織形成的花粉植株，常常會(huì)出現(xiàn)染色體倍性的變化。（主要原因是營(yíng)養(yǎng)

7、核和生殖核融合造成的。,培養(yǎng)條件：溫度控制在25左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照,3、培養(yǎng),培養(yǎng)：一般經(jīng)過(guò)20-30天培養(yǎng)后，會(huì)發(fā)現(xiàn)花藥開(kāi)裂，長(zhǎng)出愈傷組織或釋放出胚狀體 長(zhǎng)出愈傷組織則將愈傷組織及時(shí)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分化出再生植株,注意：如果花藥開(kāi)裂釋放出胚狀體，則一個(gè)花藥內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開(kāi)裂后盡快將幼小植株分開(kāi)，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開(kāi),在花藥培養(yǎng)中，特別是通過(guò)愈傷組織形成的花粉植株，常常會(huì)出現(xiàn)染色體倍性的變化（主要原因是營(yíng)養(yǎng)核和生殖核融合造成的,4、鑒定和篩選,植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的異同點(diǎn),離體的植物組織經(jīng)脫分化形成愈

8、傷組織，再分化成叢芽，誘導(dǎo)出根，然后進(jìn)行移栽,外植體為體細(xì)胞，染色體數(shù)無(wú)需加倍,取材為花藥，培養(yǎng)的為單倍體幼苗，植株弱小，高度不育，必須用秋水仙素處理，使染色體加倍，恢復(fù)正常植株的染色體數(shù)，而且為純種,練習(xí)1. 答：F2代紫色甜玉米的基因型組成可能為Aasusu或AAsusu。如果運(yùn)用常規(guī)育種方法，將F2代中的紫色甜玉米與白色甜玉米（aasusu）進(jìn)行測(cè)交，可以選擇出基因型為AAsusu純種紫色甜玉米。但這種方法比較繁瑣，耗時(shí)也較長(zhǎng)，需要至少三年的選種和育種時(shí)間。如果利用花藥培養(yǎng)的技術(shù)，在F1代產(chǎn)生的花粉中就可能有Asu的組合，再將花粉植株進(jìn)行染色體加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的純合體（AAsusu）。這種方法可以大大縮短育種周期,練習(xí)2. 答：植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)