小腸膽固醇吸收相關(guān)蛋白的研究成果綜述

1、小腸膽固醇吸收相關(guān)蛋白的研究成果綜述膽固醇是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的重要組成部分，對(duì)于維持細(xì)胞膜的通透性和流動(dòng)性起著關(guān)鍵作用，同時(shí)其在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)傳導(dǎo)、胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中也發(fā)揮著重要作用。但過(guò)高的膽固醇水平會(huì)誘發(fā)多種疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等1.研究表明，通過(guò)飲食攝入過(guò)多的膽固醇是導(dǎo)致高膽固醇血癥的主要原因，因此，有關(guān)膽固醇吸收的研究是目前脂類代謝領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一，了解小腸膽固醇吸收相關(guān)關(guān)鍵蛋白及其調(diào)節(jié)機(jī)制有助于全面了解膽固醇吸收的過(guò)程。本文主要對(duì)小腸膽固醇吸收相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。1 膽固醇在小腸的吸收過(guò)程小腸是膽固醇吸收的主要場(chǎng)所，腸腔中的膽固醇主要來(lái)源于食物、膽汁及小腸黏膜的

2、分泌。膽汁來(lái)源的膽固醇為游離膽固醇，可以被小腸黏膜直接吸收，而食物中的膽固醇部分以膽固醇酯形式存在，必須經(jīng)膽固醇酯酶水解為游離膽固醇后才能被吸收。參與小腸膽固醇吸收的蛋白眾多，其中尼曼 - 匹 克 C1 型 類 似 蛋 白 1 （ Niemann-Pick C1 like 1,NPC1L1） 主要介導(dǎo)小腸對(duì)膽固醇的吸收，小腸吸收的游離膽固醇在?；o酶 A-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶 2acyl-coenzyme A（ CoA） cholesterol acyltransferase 2,ACAT2的催化下重新形成膽固醇酯并經(jīng)淋巴液進(jìn)入血液循環(huán)，而未被酯化的膽固醇則通過(guò) ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 G5/G8

3、ATP-binding cassette（ ABC） transporters G5/G8,ABCG5/ABCG8分泌入腸腔隨糞便排出體外，轉(zhuǎn)錄因子肝 X 受體（ liver X receptor,LXR） 通過(guò)調(diào)節(jié) NPC1L1 和 ABCG5/ABCG8 的表達(dá)參與了小腸膽固醇吸收的調(diào)節(jié)。2 膽固醇吸收過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白2. 1 NPC1L1 蛋白NPC1L1 起初被認(rèn)為是尼曼 - 匹克 C1 蛋白 （ Niemann-Pick C1,NPC1） 的同源物2,NPC1 缺乏會(huì)引起游離膽固醇在神經(jīng)元溶酶體內(nèi)的聚集從而引起神經(jīng)變性和早產(chǎn)兒死亡3,4,但是其功能一直不為人所知。2004 年，Alt

4、mann 等5發(fā)現(xiàn)，NPC1L1 蛋白是參與小腸膽固醇吸收的重要蛋白，其功能才為人們所認(rèn)識(shí)。人類 NPC1L1 基因位于染色體 17P13,全長(zhǎng) 29 kb,編碼 5 kb mRNA,NPC1L1 蛋白由 1332 個(gè)氨基酸殘基組成2,5,6.如圖 1 所示，如同其同源物 NPC1,NPC1L1蛋白也有一個(gè)典型的信號(hào)肽區(qū)域，含有 13 個(gè)跨膜區(qū)和 3 個(gè)大的胞外區(qū)段7,8,其中第 1 個(gè)胞外區(qū)段為 NPC1L1 蛋白的NH2端。研究表明，在 NPC1L1 蛋白的 NH2端存在一個(gè)富含半胱 氨 酸 的 氨 基 端 結(jié) 構(gòu) 域 （ N-terminal domain,NTD） ,NPC1L1 蛋白

5、通過(guò) NTD 結(jié)合膽固醇，如果其 NTD 缺失則不能促進(jìn)膽固醇的吸收9,10; 第 2 個(gè)胞外區(qū)為膽固醇吸收抑制劑依折麥布（ ezetimibe） 的結(jié)合位點(diǎn)11.在 NPC1L1 蛋白的3 個(gè)胞外區(qū)段存在多個(gè) N-糖基化位點(diǎn)，成熟的 NPC1L1 蛋白經(jīng)過(guò)大量的糖基化修飾，這種修飾使得 NPC1L1 蛋白不易被膽汁和小腸消化液中的酶所分解12,如果糖基化位點(diǎn)發(fā)生突變會(huì)影響 NPC1L1 蛋白的成熟和功能13.此外，NPC1L1蛋白還有一個(gè)固醇感應(yīng)結(jié)構(gòu)域（ sterol sensing domain,SSD） .NPC1L1 在哺乳動(dòng)物空腸和回腸的小腸上皮細(xì)胞的刷狀緣膜表達(dá)豐富，在小腸的膽固醇

6、吸收中發(fā)揮重要作用，在人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物的肝臟中也有表達(dá)，主要參與膽汁中膽固醇的重吸收。NPC1L1 基因敲除小鼠的小腸膽固醇吸收水平降低了 70%,并且對(duì) NPC1L1 抑制劑 ezetimibe 治療不敏感，它與 ezetimibe 治療的野生型小鼠同樣表現(xiàn)出抗高脂血癥的特點(diǎn)5,14.最近有研究發(fā)現(xiàn)，ezetimibe 同樣可以降低高脂喂養(yǎng)的斑馬魚的膽固醇水平15,這些研究結(jié)果均表明 NPC1L1在小腸膽固醇吸收的過(guò)程中扮演了重要角色，但是 NPC1L1介導(dǎo)膽固醇吸收的機(jī)制尚不完全明確。研究發(fā)現(xiàn)，NPC1L1通過(guò)囊泡內(nèi)吞介導(dǎo)膽固醇的吸收，而且 NPC1L1 可以在內(nèi)吞循環(huán)體（ endocyt

7、ic recycling compartment,ERC ） 和質(zhì)膜之間循環(huán)移動(dòng)。當(dāng)膽固醇缺乏時(shí)，NPC1L1 從 ERC 轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜介導(dǎo)外源膽固醇吸收16,NPC1L1 轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜時(shí)需要 MyoVb.Rab11a. Rab11-FIP2 復(fù)合物的參與17.最近的研究發(fā)現(xiàn)，Cdc42 也參與了這一過(guò)程，當(dāng)敲除 Cdc42 后 NPC1L1 不能轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜18.細(xì)胞吸收外源膽固醇時(shí)首先由 NPC1L1 蛋白和 flotillins 蛋白形成富含膽固醇的 NPC1L1-flotillins-膽固醇膜微小結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而通過(guò) clathrin/AP2 介導(dǎo)的囊泡內(nèi)吞完成膽固醇的吸收19.ezetimib

8、e 正是通過(guò)結(jié)合至 NPC1L1,解離NPC1L1-flotillins 復(fù)合物，阻止 NPC1L1 的內(nèi)吞從而抑制膽固醇的吸收20.研究發(fā)現(xiàn)，NPC1L1 蛋白的 C 端存在一個(gè)特異的內(nèi)吞序列 YVNXXF,而 Numb 蛋白可以與該序列結(jié)合從而介導(dǎo) NPC1L1 和 膽 固 醇 的 內(nèi) 吞，當(dāng) Numb 蛋 白 敲 除 后，NPC1L1 的內(nèi)吞和膽固醇的吸收明顯減少。另外，當(dāng)膽固醇缺乏時(shí)，NPC1L1 蛋白 NTD 結(jié)合膽固醇后發(fā)生構(gòu)象變化，其C 端的內(nèi)吞序列從質(zhì)膜中暴露出來(lái)，結(jié)合 Numb,進(jìn)而招募AP2 和網(wǎng)格蛋白等，起始 NPC1L1 的內(nèi)吞21,22.研究表明，人群中膽固醇的吸收效

9、率從 29% 至 80% 不等。Cohen 等23發(fā)現(xiàn)，NPC1L1 蛋白一些非同義序列突變與膽固醇的吸收效率相關(guān)，F(xiàn)ahmi 等24鑒定出了這些突變序列。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，其中有 8 個(gè)突變序列 （ L110F,R306C,A395V,G402S,T413M,R693C,R1214H,R1268H）可以部分介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇的吸收，被定義為部分功能缺失型突變體，另有 11 個(gè)突變序列（ T61M,N132S,D398G,R417W,G434R,T499M,S620C,I647N,G672R,S881L,R1108W） 則完全不能介導(dǎo)膽固醇的吸收，被定義為完全功能缺失型突變體12.2. 2 ABC

10、G5 /ABCG8 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP 結(jié) 合 盒 轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白 超 家 族 ATP-binding cassette（ ABC） transporters superfamily在體內(nèi)膽固醇的代謝中發(fā)揮1源性可分為 7 個(gè) ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族，分別命名為 ABCA ABCG.ABCG5 和 ABCG8 蛋白屬于 ABCG 的成員，G 亞家族還包括 ABCG1、ABCG2 和 ABCG4.人 ABCG5 和 ABCG8 基因以頭對(duì)頭的方式定位于 2 號(hào)染色體 2p21,二者第一個(gè)內(nèi)含子間只相隔 140 個(gè)堿基，均含有 13 個(gè)外顯子和 12 個(gè)內(nèi)含子，分別編碼 ABCG5 和 ABCG8 蛋

11、白。與其他 ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分別含有 2 個(gè)跨膜域（ transmembrane domain） 和 2 個(gè)核苷酸結(jié)合域（ nucleotide binding domain,NBD） 不同，ABCG5 和ABCG8 蛋白只含有 1 個(gè)跨膜區(qū)和 1 個(gè) NBD,而 NBD 包含 2個(gè)保守肽序列（ 圖2） ,因此，ABCG5 和 ABCG8 蛋白屬于 ABC半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，當(dāng)它們單獨(dú)表達(dá)時(shí)是無(wú)生理功能的半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，二者必須相互結(jié)合形成異二聚體才能發(fā)揮其生理作用25.研究表明，ABCG5 和 ABCG8 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成異二聚體，然后轉(zhuǎn)移至高爾基體并最終遷移至質(zhì)膜，當(dāng)異二聚體中任何一個(gè)半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)缺乏時(shí)

12、，都會(huì)引起另一個(gè)半轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的聚集并影響其遷移至質(zhì)膜26.ABCG5 和 ABCG8 蛋白主要在小腸上皮細(xì)胞的刷狀緣膜和肝細(xì)胞的小管膜表達(dá)26.最近的研究發(fā)現(xiàn)，在人類膽囊上皮細(xì)胞的頂點(diǎn)也有表達(dá)，它們?cè)谌祟惸懝檀枷嚓P(guān)的膽結(jié)石疾病中的表達(dá)升高27.ABCG5/ABCG8 可以將小腸吸收的游離膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)回腸腔。有文獻(xiàn)報(bào)道，NPC1L1 敲除的小鼠每天可以通過(guò) ABCG5/ABCG8 通路排出 4 μmol 膽固醇28,小鼠 ABCG8 基因的缺失明顯升高了小腸對(duì)谷固醇和膽固醇的吸收29,小鼠 ABCG5 和 ABCG8 過(guò)表達(dá)則會(huì)降低谷固醇和膽固醇的吸收30.此外，研究表明在近交系小鼠

13、中，只有空腸和回腸的 ABCG5 和 ABCG8 的表達(dá)與膽固醇的吸收呈負(fù)相關(guān)31.這些結(jié)果都表明，小腸ABCG5/ABCG8通過(guò)逆轉(zhuǎn)運(yùn)小腸吸收的膽固醇降低了小腸膽固醇的吸收。研究表明，ABCG5 和 ABCG8 基因的多態(tài)性與膽固醇的吸收相關(guān)，攜帶 ABCG8. p. D19H 等位基因的個(gè)體，ABCG5 和ABCG8 的表達(dá)與對(duì)照組相比并無(wú)差異，但是膽固醇的吸收相比對(duì)照組降低了 24%32.在患高血脂的日本人群中，攜帶ABCG8 M429V 突變體的個(gè)體血清谷固醇水平明顯升高33.2. 3 ACAT2 蛋白ACAT 是一種膜結(jié)合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)催化游離膽固醇和長(zhǎng)鏈脂肪酸形成膽固醇酯，進(jìn)而形成

14、乳糜微粒并通過(guò)淋巴液進(jìn)入血液循環(huán)。在哺乳動(dòng)物中，ACAT 有 2 個(gè)亞型： ACAT1和 ACAT2,分別由不同的基因編碼。編碼人 ACAT1 蛋白的基因位于 1 號(hào)和 7 號(hào)染色體，并分別含有 2 個(gè)不同的啟動(dòng)子P1 和 P7,而 ACAT2 基因定位于 12 號(hào)染色體，由 15 個(gè)外顯子和 13 個(gè)內(nèi)含子組成，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為 46 × 103大小的 ACAT2 蛋白。ACAT1 在全身各組織均有分布，而 ACAT2 主要分布于肝細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞，催化膽固醇與長(zhǎng)鏈脂肪酸形成膽固醇酯，在生物體膽固醇的代謝中發(fā)揮重要作用。很多研究已經(jīng)表明，ACAT2 參與了小腸對(duì)膽固醇的吸收。

15、Zhang 等34以 ACAT2SI - / SI -（ 小腸 ACAT2 基因特異敲除） 和 ACAT2L - / L -（ 肝 ACAT2 基 因 特 異 敲 除） 小 鼠 為 研 究 對(duì) 象，發(fā) 現(xiàn)ACAT2SI - / SI -小鼠小腸膽固醇吸收減少，而且小腸膽固醇酯的聚集也降低，同時(shí)兩種小鼠的肝膽固醇聚集均減少。此外，兩種基因敲除小鼠均表現(xiàn)出抗飲食引起的高膽固醇血癥和抗動(dòng)脈硬化的趨勢(shì)。有人發(fā)現(xiàn)，敲除 ACAT2 基因后小鼠小腸的膽固醇吸收效率降低，而且表現(xiàn)出抗動(dòng)脈粥樣硬化趨勢(shì)35,36.3 小腸膽固醇吸收的調(diào)節(jié)小腸膽固醇的吸收水平受多種因素的調(diào)節(jié)，當(dāng)膽固醇水平升高時(shí)，小腸對(duì)膽固醇的吸

16、收降低，除此之外，轉(zhuǎn)錄因子在小腸膽固醇吸收過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。LXR 是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族，其中 LXRα 和 LXRβ 參與體內(nèi)膽固醇代謝的調(diào)節(jié)。在 Caco-2 細(xì)胞和小鼠小腸中，LXRα/β 可以下調(diào) NPC1L1 的表達(dá)37,選擇性地激活小鼠小腸 LXRα 后膽固醇的吸收降低，小腸 NPC1L1mRNA 水平降低38.ABCG5 和ABCG8 同樣是 LXRα/β 的直接靶基因，LXRs 激動(dòng)劑刺激野生型小鼠后，肝和小腸 ABCG5/G8mRNA 表達(dá)上調(diào)39,40.此外，微粒體

17、甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ mi-crosomal triglyceride transfer protein,MTTP） 敲除的小鼠給予LXR 激動(dòng)劑刺激后小腸膽固醇吸收降低41.除轉(zhuǎn)錄因子 LXR 外，其他的轉(zhuǎn)錄因子同樣可以調(diào)節(jié)膽固醇的吸收。有研究發(fā)現(xiàn)，caco-2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源性的 CDX2和 HNF1α 后，ACAT2 的表達(dá)增加，采用 RNA 干擾技術(shù)抑制caco-2 細(xì)胞內(nèi)源性 CDX2 和 HNF1α 的表達(dá)后 ACAT2 的表達(dá)降低。在 HepG2 細(xì)胞中，CDX2 表達(dá)升高的同時(shí) ACAT2 的表達(dá)也同樣升高42,利莫那班（ rimonabant） 則可以同時(shí)

18、抑制ACAT1 和 ACAT2 的表達(dá)43.4 展望目前，高血脂已成為人們普遍關(guān)注的健康問(wèn)題，由此引發(fā)的動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等疾病成為引起死亡的主要原因，降膽固醇藥物的研究是當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。迄今為止，批準(zhǔn)上市的膽固醇吸收抑制藥物只有 ezetimibe,在臨床上 ezetimibe 與他汀類藥物聯(lián)合應(yīng)用相比單一使用他汀類藥物可以更好地降低血清 LDL 的水平，但是 ezetimibe會(huì)引起血清轉(zhuǎn)氨酶升高以及肝炎等不良反應(yīng)44.分析和歸納小腸膽固醇吸收相關(guān)蛋白的最新研究進(jìn)展，我們可以尋找新的膽固醇吸收抑制劑的作用靶點(diǎn)，例如： 小腸 LXR 的特異激動(dòng)劑； ABCG5/ABCG8 激動(dòng)

19、劑； 抑制 NPC1L1 與膽固醇的結(jié)合或抑制 NPC1L1 在質(zhì)膜和內(nèi)吞循環(huán)體之間的轉(zhuǎn)運(yùn)；通過(guò)抑制 ACAT2 的表達(dá)降低膽固醇的酯化。這些都可能成為未來(lái)膽固醇吸收抑制劑的作用靶點(diǎn)，并通過(guò)后續(xù)的藥物篩選策略，開(kāi)發(fā)出新型的降脂藥物。1 Barton M. Cholesterol and atherosclerosis: modulation by oestro-genJ. Curr Opin Lipidol,2013,24（ 3） : 214 - 220.2 Davies JP,Levy B,Loannou YA. Evidence for a Niemann-Pick C（ NPC ） gene family: identification and characterization ofNPC1L1J. Genomics,2000,65（ 2） : 137 - 145.3 Carstea ED,Mo