生物樣品前處理方法

1、生物樣品前處理方法,content,生物樣品處理目的,前處理過(guò)程及方法,分析方法的限度要求,生物樣品的種類,血樣,根據(jù)藥物具體性質(zhì)選擇,血清（serum,全血 （whole blood,血漿（plasma,置含有抗凝劑的試管中，25003000rpm離心510min，淡黃色上清液，約為全血的50-60% 藥物動(dòng)力學(xué)，生物利用度，臨床治療藥物濃度監(jiān)測(cè),置試管中，于37或室溫放置30min1h，血液 凝固后，剝?nèi)ピ嚬鼙谏系难灒?5003000rpm離心510min，淡黃色液體，約為全血20-40% 血清的獲取量小，但血清成分更接近于組織液的化學(xué)成分，測(cè)定血清中有關(guān)物質(zhì)的含量，比全血更能反映機(jī)體的

2、具體情況,加入抗凝劑混合，防止凝血后影響測(cè)定 對(duì)于與紅細(xì)胞結(jié)合的藥物，以及血漿濃度低或藥物在血漿與紅細(xì)胞分配比不恒定的情況下應(yīng)用,一. 生物樣品的種類,唾液（saliva,尿液(urine,一般采集時(shí)間尿（規(guī)定時(shí)間內(nèi)采集尿液體積和排入尿中的藥物總量）藥物濃度高，但變化 體內(nèi)藥物清除 以原形、I相及II相代謝物等多種形式通過(guò)尿液排出排出 預(yù)測(cè)藥物代謝過(guò)程、類型,計(jì)算藥物尿清除率、生物利用度的研究,在漱口后15min，安靜狀態(tài)下采集口腔內(nèi)自然流出的唾液；也可在刺激下快速采樣，石蠟片，聚四氟乙烯塊，紗布球，檸檬酸，維生素C等置于舌尖，棄取初始部分后采集 血漿游離藥物濃度（P）密切相關(guān)，可使用唾液樣品

3、CS/CP比值較恒定時(shí)，可代替血樣進(jìn)行TDM及藥代動(dòng)力學(xué)研究,去除生物樣品中的大分子雜質(zhì)，滿足測(cè)定方法對(duì)分析樣品的要求,保護(hù)儀器性能，改善分析條件,分離并富集所要測(cè)定的成分,藥物從綴合物及結(jié)合物中釋放測(cè)定藥物的總濃度,二.生物樣品處理的目的,生物樣品,3.衍生化,三.前處理過(guò)程及方法,1.1-溶劑解法,原理：使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變 化而使蛋白質(zhì)凝聚 。 常用有機(jī)溶劑：乙腈、甲醇、丙酮、四氫呋喃 試劑用量：溶劑體積與血樣比為13 1 操作：有機(jī)溶劑與血漿或血清按一定比例混合后 離心分離，取上清液作為樣品。注意采用 超速離心 （12000rpm）分離12min,1.2 加入中性鹽,原

4、理：中性鹽使蛋白質(zhì)脫水而沉淀 常用中性鹽：飽和硫酸銨、硫酸鈉、鎂鹽、磷酸鹽 及枸櫞酸鹽等 試劑用量：飽和硫酸銨與血清比例為21 操作：血清與中性鹽按一定比例混合后超速離心 （10000rpm）分離12min，取上清液作為樣品。上清液pH 7.07.7,1.3 加入強(qiáng)酸,原理：強(qiáng)酸與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而沉淀。 常用：10三氯醋酸、6高氯酸、5偏磷酸等。 操作：血清與強(qiáng)酸的比例為1：0.6混合，離心（10000rpm）12min，即可。 上清液 pH 04，不適于酸性下分解的藥物。 過(guò)量酸的排除：過(guò)量三氯醋酸可通過(guò)煮沸或乙醚提取除去；高氯酸、偏磷酸等可用碳酸鉀、醋酸鉀或氫氧化鈉等中和后加乙醇使產(chǎn)生

5、高氯酸鉀（鈉）沉淀被除去,1.4 酶水解法,測(cè)定一些酸不穩(wěn)定及蛋白結(jié)合牢的藥物 枯草菌溶素：使組織溶解，使藥物析出。 一種細(xì)菌性堿性蛋白分解酶，可在較寬的pH活圈（PH7.011.0）內(nèi)使蛋白質(zhì)的肽鍵降解，在5060具有最大活力。 優(yōu)點(diǎn)：可避兔某些藥物在酸及高溫下降解，對(duì)與蛋白質(zhì)結(jié)合牢的藥物（如保泰松、苯妥英納），可顯著改善回收率；可用有機(jī)溶劑直接提取酶解液而無(wú)乳化現(xiàn)象。 不適用于在堿性下易水解的藥物,1.5 超濾法,性質(zhì)：以多孔性半透膜（超濾膜）作為分離介質(zhì)的一種膜分離技術(shù)。 特點(diǎn)：無(wú)需加熱；無(wú)需添加化學(xué)試劑；無(wú)相變化；無(wú)破壞性；樣品量少；簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果穩(wěn)定可靠 應(yīng)用：游離藥物首選方法，尤其

6、適合TDM 操作：分子量截留值在5萬(wàn)左右的超濾膜過(guò)濾可將分子量大的血漿蛋白以及結(jié)合了藥物的血漿蛋白分離,2、綴合物的水解,由于綴合物較原型藥物具有較大的極性，不易被有機(jī)溶劑提取，所以： 酸水解可加入適量的鹽酸液。 酶水解對(duì)于遇酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，常用 葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶或兩者的混合酶,3.分離、純化和濃集3-1. 液-液萃取法 LLE,乳化現(xiàn)象：加固體NaCl；離心；低溫冰箱中快速凍凝 對(duì)于極性大的藥物：離子對(duì)提取法；提取烷基化法,堿性； 親脂性的,3-2. 固相萃取法 SPE,原理：不同填料作固定相的微型小柱，當(dāng)含有藥物的生物樣品溶液通過(guò)時(shí)，由于受到吸附、分配、離子交換或其它親和力作

7、用，藥物或雜質(zhì)被保留在固定相上，用適當(dāng)溶劑清洗雜質(zhì)后，再用適當(dāng)溶劑洗脫藥物。 親脂型大孔吸附樹(shù)脂，親脂型鍵和硅膠 規(guī)格 親水型硅膠，硅藻土，棉纖維 離子交換型,3-2. 固相萃取法 SPE,甲 醇,柱預(yù)處理 進(jìn)樣 凈化 洗脫,水,樣 品,弱溶 劑,強(qiáng)溶 劑,固相提取步驟示意圖,被測(cè)組分的濃集,真空蒸發(fā)或抽真空揮發(fā) 直接通入氣流使溶劑揮發(fā),氮?dú)饣蚩諝?藥物或代謝物,4.化學(xué)衍生化,GC衍生化反應(yīng)類型： 烷基化；?；?；硅烷化 活潑氫被烷基、?；⒐柰榛〈?HPLC-化學(xué)衍生化方法,先進(jìn)的處理技術(shù) 1. 固相微萃取 SPME,基于待測(cè)物質(zhì)在樣品和萃取涂層中的平衡分配的過(guò)程。 相似相溶原理 材料： 聚二甲基硅氧烷 聚丙烯酸酯,SPME 與GC 及HPLC聯(lián)用,2. 柱切換技術(shù),是一種在線的固相分離技術(shù),切換閥,3. 微透析技術(shù),MD是一種膜分離技術(shù)，利用膜透析原理，對(duì)細(xì)胞液進(jìn)行流動(dòng)性連續(xù)采樣，在不破壞生物體內(nèi)環(huán)境的情況下，直接插到生物活體內(nèi)采樣進(jìn)行原位測(cè)定 將微透析探針