探討GnIH參與母豬生殖調(diào)控的可能機(jī)制

1、探討GnIH參與母豬生殖調(diào)控的可能機(jī)制0 、引言促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone，GnIH）是 Tsutsui 等于 2000 年在鵪鶉下丘腦內(nèi)分離到的一種神經(jīng)肽，哺乳動(dòng)物的類似物為 RF 酰胺相關(guān)肽（RFRP）。具有抑制促性腺激素分泌和影響性行為、攝食、生長(zhǎng)激素分泌等作用。豬作為中國(guó)重要的家畜之一，繁殖能力是決定其養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的主要因子。因此，研究 GnIH/ RFRP對(duì)母豬生殖調(diào)控的機(jī)理具有重要的理論意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。國(guó)內(nèi)外已對(duì)鳥類、魚類、兩棲類及人、鼠、猴、牛、羊等的 GnIH 及其受體的基因克隆、分布定位和生理功能做了大量研究。已有研究顯

2、示，GnIH/RFRP 通過(guò)其受體發(fā)揮作用，其特異性受體為 GPR147，為具有 7 次跨膜結(jié)構(gòu)域的 G 蛋白耦聯(lián)受體（GPCR）。關(guān)于 GnIH 分布的研究，主要集中在腦部，GnIH 在外周分布的研究相對(duì)較少。有報(bào)道顯示GnIH mRNA 除在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有表達(dá)外，在眼、卵巢、睪丸、脾、腎等外周組織中也有表達(dá)。除了下丘腦和垂體，GnIH 及其受體已被證實(shí)在許多鳥類的性腺中分布，并通過(guò)旁分泌或自分泌的形式參與生殖調(diào)控10。此外，GnRH 和 GnIH 的信號(hào)通路存在相互作用11-12。目前，有關(guān) GnIH 對(duì)哺乳動(dòng)物生殖功能調(diào)控的研究較少，且尚未見(jiàn)對(duì)豬的研究報(bào)道。本文對(duì)GnIH mRNA 在母

3、豬體內(nèi)的表達(dá)模式，不同劑量 GnIH 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞類固醇激素分泌和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以及GPR147 與GnRH 的形態(tài)學(xué)關(guān)系進(jìn)行了研究，從分子和蛋白水平入手，旨在探討 GnIH 參與母豬生殖調(diào)控的可能機(jī)制，為全面而深入地研究GnIH 生理功能提供理論基礎(chǔ)。1、 材料與方法試驗(yàn)于 2010 年 10 月至 2012 年 11 月，在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心完成。1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及材料30 日齡健康蘇鐘仔母豬 7 頭，體重為（10±2）kg，購(gòu)自江蘇省農(nóng)科院蘇鐘種豬場(chǎng)。試驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)頸總動(dòng)脈放血處死，4 頭動(dòng)物立刻取其延髓、腦橋

4、、中腦、大腦、小腦、下丘腦、海馬、嗅球、脊髓、垂體、心、脾、腎、腎上腺、胃、眼球、卵巢、子宮、肝、腸（十二指腸、空腸、回腸、盲腸和結(jié)腸）、腰大肌、膽囊和膀胱，迅速投入液氮冷凍，然后轉(zhuǎn)入-70凍存，用于GnIH 表達(dá)研究。3 頭動(dòng)物取其下丘腦，按照文獻(xiàn)13的方法固定下丘腦和制作腦片，用于GnRH和GPR147定位研究。卵巢樣品采自 36 頭三元雜交長(zhǎng)白青年母豬，體重（90±5）kg，均來(lái)自江蘇省天環(huán)食品有限公司。宰殺后，打開腹腔取出兩側(cè)卵巢。按照文獻(xiàn)14的方法分離培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞。6 孔細(xì)胞板中加入 1×106個(gè)/mL 的卵巢顆粒細(xì)胞懸液，37靜置培養(yǎng) 72 h 后，棄

5、去培養(yǎng)液，加入 10-6、10-8、10-10和 10-12mol·L-1GnIH 靜置培養(yǎng) 24 h 后，收集上清，-20保存，用于放射免疫法檢測(cè) E2和 P4的濃度；處理后的卵巢顆粒細(xì)胞用蛋白裂解液裂解后，收集于 EP 管，-20保存用于 Westernblotting。1.2 主要試劑與儀器Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA 酶抑制劑（RNase inhibitor）、dNTPs、寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸（Oligo d（t）18）、rTaq DNA 聚合酶、SYBR PremixEx Taq Kit 購(gòu)自 Takara 公司；DMEM/F12、D-Hanks、胎牛

6、血清、胰蛋白酶、青鏈霉素購(gòu)自南京維森特生物有限公司；40%Acr-Bis（391）、TEMED、麗春紅染色液、western 細(xì)胞裂解液、超敏 ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、鼠抗羊 IgG、PVDF膜、厚濾紙購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。兔抗人 NPFF-1R（GPR147）（185-203）（H）多克隆抗體，貨號(hào)：H-001-58，Phoenix Pharmaceuticals，USA；羊抗 GnRH，cyclin B1，PCNA 和 β-actin，購(gòu)自 SANTA CRUZ，USA；驢抗山羊羅丹明（TRITC）標(biāo)記的熒光二抗和驢抗兔異硫氫酸熒光黃標(biāo)記的熒光二抗

7、（FITC）（Jackson Immunoresearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA），正常驢血清（Jackson，WestGrove，PA，USA），購(gòu)自上?；蚬?；人 RFRP-3（GnIH）（貨號(hào)：No. 048-46，Phoenix Pharmaceuticals，USA）；P4和 E2放射免疫試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。ABI PRISM 7300 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀為美國(guó) ABI公司產(chǎn)品；制膠器、垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)印儀為美國(guó)Bio-red 公司產(chǎn)品；激光共聚焦顯微鏡為德國(guó) zeiss 產(chǎn)品。1.3 試驗(yàn)方法及步驟1.3.1 半定量

8、 RT-PCR 母豬 24 個(gè)組織的總 RNA 提取按照 Trizol 試劑說(shuō)明書在無(wú) RNA 酶的環(huán)境下進(jìn)行。提取的 RNA 進(jìn)行均一性和完整性檢測(cè)。RNA 在無(wú)RNA 酶的環(huán)境下按兩步法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以 GAPDH 為cDNA 合成及 PCR 內(nèi)源性參照，用混合樣品（取各待測(cè)樣品 cDNA 等量混合）作為模版，分別對(duì) PCR 反應(yīng)條件和循環(huán)圈數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳 PCR 反應(yīng)條件和校正不同批次間RT和PCR效率的差異。取20 ?L PCR產(chǎn)物在 2.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠染色，紫外光下顯示 DNA 條帶并照相。用 Kodak ID 凝膠圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度，根據(jù)目的基因 GnI

9、H 和內(nèi)參GAPDH 的 PCR 產(chǎn)物的灰度比，確定各樣品組織中的GnIH mRNA 表達(dá)的相對(duì)含量。1.3.2 放射免疫測(cè)定 所有卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2和 P4的含量均用同一批 I125標(biāo)記的 E2和 P4放射免疫試劑盒檢測(cè)。E2的測(cè)定范圍：85 000 pg·mL-1；靈敏度：2 pg·mL-1；批內(nèi)變異系數(shù)（CVw）10%；批間變異系數(shù)（CVb）15%。P4的測(cè)定范圍：0.2100ng·mL-1；靈敏度：0.1 ng·mL-1；批內(nèi)變異系數(shù)（CVw）6.7%；批間變異系數(shù)（CVb）9.4%。1.3.3 Western blotti

10、ng 測(cè)定 Western blotting 按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，封閉，孵育一抗，孵育二抗，加入 ECL 化學(xué)發(fā)光液，按時(shí)曝光，掃描膠片進(jìn)行灰度分析。其中，一抗羊抗 PCNA 稀釋比 1200，Cyclin B1 稀釋比 1200，β-actin 稀釋比 11 000，二抗羊抗兔 IgG 稀釋比 11 000。1.3.4 熒光雙標(biāo)記 切片經(jīng) 37恒溫箱干燥 3 h，洗滌，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，用正常驢血清的緩沖液封閉非特異性抗原。滴加抗 GPR147 特異性抗體（1400 稀釋）孵育。洗滌后用驢抗兔 FITC 熒光標(biāo)記的二抗孵育。充分洗滌，抗

11、 GnRH 特異性抗體（1200稀釋）孵育，PBS 洗 3 次/5 min，再用驢抗兔 TRITC 標(biāo)記的熒光二抗孵育，充分洗滌后甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SE）表示。數(shù)據(jù)處理應(yīng)用 SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)，同一處理不同濃度之間的比較采用單因子方差分析（one-wayANOVA），LSD 檢驗(yàn)各組之間的差異顯著性。檢驗(yàn)結(jié)果以 P0.05 為差異顯著，P0.01 為差異極顯著。2、 結(jié)果2.1 GnIH mRNA 在母豬 24 個(gè)組織中的表達(dá)根據(jù)目的基因 GnIH 和內(nèi)參 GAPDH 的 PC

12、R 產(chǎn)物條帶（圖 1-A 和 B）灰度比，分析得出 GnIH mRNA在母豬各器官組織中的表達(dá)情況為：高豐度表達(dá)組織（GnIH 與 GAPDH 灰度比大于 0.1）：間腦、延髓、腦橋、中腦和嗅球。中豐度表達(dá)組織（GnIH 與 GAPDH灰度比小于 0.1 大于 0.025）：大腦皮質(zhì)、海馬、眼、子宮、卵巢和膽囊。低豐度表達(dá)組織（GnIH與GAPDH灰度比小于 0.025 大于 0）：小腦、垂體、脊髓、腎上腺、腰大肌和腸。無(wú)表達(dá)組織：心、腎、脾、肺、胃、肝和膀胱（圖 1-C）。2.2 GnIH 對(duì)豬卵巢細(xì)胞類固醇激素釋放的影響GnIH 影響體外培養(yǎng)豬卵巢顆粒細(xì)胞類固醇激素的釋放。如圖 2 所示，

13、10-6和 10-10mol·L-1GnIH 能極顯著地抑制雌二醇的分泌（P0.01），其他劑量組差異不顯著。如圖 3 所示，不同劑量（10-6，10-8，10-10和 10-12mol·L-1）GnIH 對(duì)孕酮的分泌與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異。2.3 GnIH 對(duì)豬卵巢細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響cyclin B1 的免疫印跡顯示單一條帶，為 55 kD。研究了不同劑量 GnIH 對(duì)母豬卵巢顆粒細(xì)胞中 cyclinB1 表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比對(duì)，所有劑量組中只有 10-6mol·L-1GnIH 對(duì) cyclin B1 的表達(dá)具有極顯著的抑制作

14、用（圖 4）（P0.01），其他劑量組（10-8、10-10和 10-12mol·L-1）GnIH 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞cyclin B1 的表達(dá)影響不顯著。PCNA 的免疫印跡顯示單一條帶，為 36 kD。研究結(jié)果顯示，不同劑量的 GnIH 對(duì)母豬卵巢顆粒細(xì)胞中 PCNA 的表達(dá)均具有顯著的抑制作用（圖 5）。低劑量組（10-10和 10-12mol·L-1）GnIH 能極顯著抑制PCNA 的表達(dá)（P0.01），抑制作用強(qiáng)于高劑量組（10-6和 10-8mol·L-1GnIH）（P0.05）。2.4 GPR147 與 GnRH 的共存關(guān)系本研究結(jié)果顯示，G

15、PR147 與 GnRH 在視前區(qū)及室旁核可見(jiàn)有陽(yáng)性胞體與胞體或纖維密切接觸（圖 6）。3、 討論3.1 GnIH 與下丘腦-垂體-性腺軸目前的研究顯示，GnIH 及其受體不僅在下丘腦-垂體-性腺軸有分布，而且 GnIH 可在下丘腦、垂體和性腺 3 個(gè)水平調(diào)控生殖相關(guān)激素的合成和分泌。因此GnIH 對(duì)生殖調(diào)控的相關(guān)研究主要集中在下丘腦-垂體-性腺軸。GnIH 在下丘腦對(duì)生殖的調(diào)控主要是通過(guò)對(duì)下丘腦中生殖相關(guān)神經(jīng)肽（如GnRH、褪黑激素和kisspeptin等）的相互調(diào)節(jié)完成的。GnIH 與 GnRH 在羊下丘腦的形態(tài)學(xué)研究顯示，GnIH 與 GnRH 在視前區(qū)有突觸接觸。GnIH 對(duì) GnRH

16、 影響的電生理學(xué)研究顯示，GnIH 能抑制雌性和雄性大鼠腦片中 49% 的細(xì)胞GnRH 的釋放頻率。有研究提出 GnRH 并不是下丘腦中唯一能夠調(diào)控促性腺激素的作用因子，kisspeptin 和 GnIH 也能在下丘腦中調(diào)控促性腺激素的釋放，并且 kisspeptin 和 GnIH 互為拮抗物，共同調(diào)節(jié)下丘腦中 GnRH 的合成和分泌。GnIH 在垂體水平參與動(dòng)物生殖的調(diào)控，主要是通過(guò)影響促性腺激素的合成和釋放。2000 年，Tsutsui等首次分離到 GnIH 時(shí)，即通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種神經(jīng)肽能抑制垂體前葉 LH 和 FSH 的分泌，此外，免疫組織化學(xué)法研究證明 GnIH-ir 神經(jīng)元投射到

17、下丘腦中最接近垂體的位置ME。GnIH 在性腺對(duì)生殖的調(diào)控主要體現(xiàn)在對(duì)排卵的調(diào)控，參與性腺的發(fā)育等。已有的研究顯示，當(dāng)排卵前 LH 峰到來(lái)時(shí)，下丘腦 GnIH 神經(jīng)元的數(shù)量和 GnIH在卵巢中的表達(dá)均降低，證明 GnIH 參與調(diào)控動(dòng)物的排卵。Singh 等研究發(fā)現(xiàn) GnIH 可影響小鼠卵巢的組織學(xué)變化，與健康卵泡相比，給小鼠體內(nèi)服用 GnIH 后，卵泡中出現(xiàn)異常和退化的黃體，卵巢顆粒細(xì)胞核濃縮或者肥大、卵巢膜細(xì)胞肥大或形成空泡，卵母細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)也出現(xiàn)異常，提示 GnIH 可能參與調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡。關(guān)于 GnIH 在生殖調(diào)控方面的研究才剛剛開啟，其調(diào)節(jié)作用機(jī)制尚不清楚，在哺乳動(dòng)物研

18、究尚未深入。本試驗(yàn)針對(duì)母豬，從性腺水平入手探討GnIH 的微調(diào)作用。3.2 GnIH mRNA 在母豬各組織中的表達(dá)目前，人們已研究了許多動(dòng)物 GnIH 及 GPR147mRNAs 在組織中的表達(dá)情況。Ikemoto 和 Park 研究發(fā)現(xiàn)雞 GnIH mRNA 僅在間腦表達(dá)，其受體則在間腦、端腦、視頂蓋中表達(dá)，在卵巢中無(wú)表達(dá)。但是Maddineni 等利用不同的 PCR 引物和步驟則從雞的卵巢和睪丸中擴(kuò)增出 GnIH 受體片段。在日本鵪鶉，GnIH 受體在間腦、端腦、中腦、脊髓及垂體中有表達(dá)。最近，Zhang 等研究發(fā)現(xiàn) GnIH mRNA 主要表達(dá)于斑馬魚的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼、卵巢和睪丸，在

19、脾、腎中有少量表達(dá)。在哺乳動(dòng)物，僅在人和大鼠做了相關(guān)的表達(dá)研究。Hinuma 等研究發(fā)現(xiàn) GnIH mRNA 在大鼠下丘腦、眼及睪丸，GPR147 mRNA 在垂體、睪丸、卵巢及胎盤中高表達(dá)。但是 Bonini 等卻得出不一樣的結(jié)論，他研究了 GPR147 mRNA 在人 24 個(gè)組織及大鼠 41 個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示 GPR147mRNA 除了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高表達(dá)外在許多外周組織如脾、腎、腸等也有較高豐度的表達(dá)。不同物種的研究結(jié)果可能由于引物條件或種屬特異性導(dǎo)致結(jié)果不太一致，但是 GnIH 及 GPR147 mRNAs 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)具有高表達(dá)則是物種間保守的。本研究結(jié)果

20、也印證了這一點(diǎn)，豬 GnIH 及 GPR147 mRNAs主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，且豐度較高，在卵巢和子宮呈中等表達(dá)，提示 GnIH 可能通過(guò)中樞調(diào)控動(dòng)物的生殖活動(dòng)。值得注意的是 GnIH 及 GPR147 mRNAs均在下丘腦表達(dá)豐度最高，GPR147 mRNA 在垂體的表達(dá)豐度僅次于下丘腦，提示 GnIH 及其受體可能具有多種生理功能，GnIH 可通過(guò)其受體在下丘腦水平影響 GnRH 來(lái)參與動(dòng)物的生殖調(diào)控。在垂體水平，GnIH可通過(guò)其受體調(diào)控垂體前葉促性腺激素的合成和釋放。此外，GnIH 及 GPR147 mRNAs 在卵巢及子宮中也有中等以上程度的表達(dá)，提示 GnIH 也可能在卵巢水平

21、調(diào)控性激素的合成釋放或者參與卵泡的募集等一系列生殖活動(dòng)。GnIH 及其受體 mRNA 還在腎上腺、腎及腸道中表達(dá)，推測(cè) GnIH 系統(tǒng)可能還參與應(yīng)激和攝食等生理活動(dòng)，但目前尚無(wú)豬 GnIH 在應(yīng)激和攝食等方面的研究報(bào)道。3.3 GnIH 對(duì)母豬卵巢類固醇激素分泌的影響在母豬卵巢水平，已有研究證實(shí) GnIH 及其受體在卵巢中分布，而且它們?cè)谏持芷诓煌瑫r(shí)期的表達(dá)也呈現(xiàn)規(guī)律性波動(dòng)，提示 GnIH 在母豬卵巢水平可通過(guò)旁分泌或自分泌形式調(diào)控性激素的分泌、卵泡的發(fā)育等，從而參與母豬的生殖調(diào)控。本試驗(yàn)深入探討了GnIH對(duì)體外培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞性激素分泌的影響，研究發(fā)現(xiàn) GnIH 能顯著抑制卵巢顆粒細(xì)胞中

22、E2的分泌，但對(duì) P4的分泌影響并不顯著。Oishi 等最新的研究發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果一致，RFRP-3 能顯著抑制FSK、LH 和 FSH 誘導(dǎo)的 P4的分泌，但卻對(duì)8-Br- cAMP（8-bromoadenosine 3′5′-cyclic monophosphate）誘導(dǎo)及基礎(chǔ)分泌的 P4影響并不顯著，此外，加入雙功能的GPR147 阻斷劑 RF9 或者 GPR147 siRNA 后 P4的分泌則顯著上升。目前，GnIH/RFRP-3 在卵巢水平參與動(dòng)物生殖調(diào)控的研究較少，GnIH/RFRP-3 在卵巢的生理功能和作用機(jī)制尚不明確，還需要更多更深入的研究。3.4 GnIH 對(duì)母豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響本試驗(yàn)首次證明了 GnIH 能在哺乳動(dòng)物卵巢中抑制細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)。有研究顯示 cyclin B1 及PCNA 分別參與了卵巢細(xì)胞有絲分裂 S 期和 G1 后期細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化。本研究發(fā)現(xiàn) GnIH 能抑制卵巢顆粒細(xì)胞中周期蛋白 cyclin B1 及 PCNA 的表達(dá)。因此，推測(cè) GnIH 可能通過(guò)影響卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)