Seahorse海馬代謝儀使用說明

1、seahorse,匯報 學號,背景,生物能量學（bioenergetic） 探討的是生物將氧份轉為能量并借此推動生命的過程。不同的細胞依據(jù)其生理特性及健康狀況，能量供需系統(tǒng)亦有所不同,簡介,美國海馬生物科學利用細胞外流量（extracellular flux，xf）檢測專利技術，發(fā)明了業(yè)界第一款海馬細胞能量代謝實時測定儀/生物能量代謝測定儀（seahorse xf extracellular flux analyzers），是進行細胞代謝分析、氧呼吸測定、藥物代謝分析、線粒體有氧代謝和糖酵解等功能的最佳分析工具。 特點：通過特殊的細胞培養(yǎng)微孔板設計，在測量時臨時形成的約2ul微環(huán)境中，利用無創(chuàng)

2、的專利光學傳感器同步地實時探測溶解氧（ocr）和細胞外酸化率（ecar）變化，從而快速了解細胞內兩大能量轉換途徑（線粒體的有氧代謝和糖酵解）的能量代謝狀態(tài),儀器外觀,hydro booster,sensor cartridge,cartridge lid,耗材,自動藥物注射端口 啟用實時功能分析,cell mito stress test assay kits,水化探針,1.在utility plate每孔中加入1ml校準液 (seahorse xf 校準液用于溶解和校準 xf 小柱，并包含 fluxpak,實驗前一天,2.將hydro booster放在utility plate上，sens

3、or cartridge放在最上面,3.放入無co2的培養(yǎng)箱，37過夜（使校準液能浸沒在sensors中；保證培養(yǎng)箱濕度，防止干燥,培養(yǎng)細胞,1.100ul培養(yǎng)液收集細胞，按最佳細胞密度重懸細胞（10,000 - 80,000個細胞/孔）。 2.每孔接種100 l細胞懸液，背景校正孔（a1, b4, c3, d6）不接種細胞。將細胞板室溫靜置在超凈臺上1 h。 3.將細胞板放置在細胞培養(yǎng)箱中讓細胞貼壁（快1h；慢5-6h），在顯微鏡下觀察細胞是否貼壁。 4.細胞貼壁后，每孔加入150 l生長培養(yǎng)液，總體積為250 l。加液時，沿壁輕輕加入，避免吹起剛貼壁的細胞。 5.將細胞放置在細胞培養(yǎng)箱中過

4、夜培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài),預熱儀器,打開seahorse儀器和電腦，并打開軟件，使儀器升溫至37 ，過夜預熱,準備xf檢測液,一個培養(yǎng)板 手動加液需100ml，儀器加液需200ml 1.使用naoh調節(jié)ph值至7.350.05 2.檢測液中所需要添加的底物及濃度取決于細胞類型和實驗設計，或者與生長培養(yǎng)基保持一致。 3.37放置備用,no sodium bicarbonate low phenol red (3 mg/l,實驗當天,處理細胞,1.將細胞培養(yǎng)板從co2培養(yǎng)箱中取出，并記錄時間。 2.在顯微鏡下觀察細胞（無污染，細胞均勻狀態(tài)好，貼壁未脫落，背景矯正孔無細胞。） 3.用xf

5、細胞線粒體壓力測試檢測液洗細胞： a.吸去生長培養(yǎng)液至每孔剩余50 l。 b.用1 ml xf檢測液洗細胞兩次。 c.每孔加入檢測液至終體積為500 l/孔。 4.在顯微鏡下觀察細胞，確認細胞在換液過程中沒有脫落。 5.將細胞板置于37c無co2培養(yǎng)箱中1 h,配制xf細胞線粒體壓力測試盒中藥物母液,將藥物稀釋為10濃度，用于加到加藥孔中,3.取300 l 50 m rotenone/antimycin a母液至2700 l檢測液中,2.按以下表格，用檢測液將fccp稀釋為不同的濃度,1.按左邊表格，用3 ml 檢測液將oligomycin稀釋為所需濃度（或使用大多數(shù)細胞都適用的1 m,加藥,

6、從無co2培養(yǎng)箱中取出已水化的測試板。按以下說明，將藥物分別加到每個加藥孔里。 加藥孔a：細胞孔內oligomycin終濃度為1 m。每個a孔加入56 l 10藥物。 加藥孔b：測定濃度的fccp。將62 l 10的不同濃度藥物加入到b孔里。 加藥孔c：細胞孔內rot/aa終濃度為0.5 m。每個c孔加入69 l 10藥物,選擇模板（提前預熱,injection strategies-add-strategy 1-a-add-mito stress test1,b c同樣,pretreatment-add-不用做修改,assay media-mito stress test medium,填寫

7、相關信息：name ,cell type, seeding density（cell type2，3， 4 同樣），之后點擊“generate group”查看,plate map”設置顏色,默認的 mix-wait-measure時間為3 min-2 min-3 min。通常在加藥前測量3次基礎值；每次加藥后再進行3次測量。 “injection”多少種藥點多少次,review run-plate information-well volume-plate by-start run，放入測試板。當軟件出現(xiàn)校準完成提示時，將utility板換為細胞培養(yǎng)板。點擊continue。儀器完成ocr值測定，數(shù)據(jù)分析,寡霉素：atp合酶抑制劑； fccp：解偶聯(lián)劑 ； 抗霉素a/魚藤酮：呼吸鏈抑制劑,how do i know whether the cell density is good,basal ocr range: 20-160 pmol/min maximum recommended ocr: 400 pmol/min ecar: 5-100 mph/min,優(yōu)勢特點,采用超敏感的生物傳感器和非接觸式設計，真正實現(xiàn)檢測細胞零損傷； 實時檢測細胞有氧