堿裂解法質(zhì)粒提取

1、戚農(nóng)解法捉取血粒利用的足共價閉合環(huán)狀隨純DNA吋線狀的染色體DNA片段的們卜學(xué)I:的雄井來分離它們.在pH ift介干12. 0-12. 5 這個狹窄的范國內(nèi)線狀的DNAXX螺旋結(jié)構(gòu)牌開變件共價閉壞質(zhì)粒DNA的做他如然斷裂但兩條互補謹(jǐn)彼此依然相互盤繞而緊纟炮結(jié) 介在一起.WApHI.S的酣酸鉀簡鹽緩沖液便閉拜低后.其價閉介環(huán)狀的歷林DXA的兩條互補璉迅速而準(zhǔn)確地芟件.而線狀的染色體 DXA的兩條互補謚彼此已龍全分開.不能迅速而準(zhǔn)確地更性它心綢繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).通過離心.染色體DNA9不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋 白ffi-SDS更合物彎一起沉淀下來.而質(zhì)桂DM知留在上淸液中.儀器、材料與試劑儀器：恒

2、溫堵養(yǎng)箱、恒SA晞床、小型島速離心機、島斥滅肅鍋.材料：帶有質(zhì)枝的大腸桿菌試劑：Solution ICmaol / L 匍荀橢rnnol/L 三疑甲基氮基甲烷(TMjTrxHC1 (pHS. 01.0 so /L 乙二胺四乙酸(EDTA) (pHS. 0)Solution II0. Inol/L NaOH. 2%SDS(十二烷雄晞酸鈉).用前答體枳混合Solution III5rxol /L 鉀 GO aL冰乙酸11.3mL水2S. 5mLTB級沖液lCmsol / L Tris HC1laizol/L EDTAipHS. 0)WRNAttlRXAttA)W RXA fftitt 于 1 Cm

3、aol/L Tris -HCKpHT.S). IZol/LhCl 中.配成 10之/丄 的濃度.干 KXTC 加熱 15min.緩慢冷卻至室船.保存于-20-C.實!臉步曝（采用SDS堿裂解法小駅別備脈林DMD1. 大腸桿菌培養(yǎng)2. 捉取幀粒3. 質(zhì)林的瓊冊輸凝膠電泳實鮒操作步曝I. 將過夜培弊的2=1細(xì)繭.高速離心1分鐘.徹，底去除上淸.2加入lOCtnl solution I.用槍頭或抿蕩話充分懸浮細(xì)茵3加入200ml Solution IE立即上下頗倒或用手指彈管底使細(xì)0B稷解.室溫放立（2分鐘左右）至藩液竇成蹄.4. 加入lOCtnl Solution III.立即上下碩倒5-10次.

4、便Z充分中和.室溫放立2分鐘.注總：步驟2和3在冰上探作效果更佳.5. 島速離心15,000轉(zhuǎn)/分鐘.10分計.無篙低盤炭心.注世：捉島離心速度使沉徒更加緊密.步驟6操作取上淸更為方便.6. 取出A1樣&收集訝和35柱在管壁標(biāo)上樣胡號.將步驟5中的上淸全部轉(zhuǎn)移到似或倒入）3S柱里.蓋上離心管蓋子.室昭放 ?12分俳（室盤放近時間不業(yè)要.可長可短：用臺兀離心機室盤冊連12000轉(zhuǎn)/分鐘）燙心1分忡.注直 轉(zhuǎn)移上淸時不耍吸取沉淀.否則會出現(xiàn)Genoiric DNA和蛋F傾污染.離心管蓋子缶上時柱子內(nèi)斥的增加可能會使部分溶液從柱子底器漁出為正曲現(xiàn)欽.7. 取下3S柱.棄去掉收集管中的廢液.將3S柱放

5、入同一支收集管中吸700ml Wash Solution到3S柱離心1分鐘.s. 步驟7 一衣.9. 取下35柱棄去憚收集管中的廢液將3S柱放入何一支收集管中.島速離心2分鐘.10. 將3S柱放入干凈的15ml的離心營中.在3S柱子股中央加SOMITE或水.不要蓋上離心管陰 室爲(wèi)下放M 2分佻 孟上離心仔蓋. 室隘島速離心1分鐘.注童：將充戒水預(yù)想到50C左右可以捉局洗脫效率.測用用歷粒用30=1預(yù)羔的水洗脫.濃度般滿足測片:耍求.II. 洗脫的頁杭可以立即用于各種分子生物學(xué)操作或70C保存?zhèn)溆?1過夜焰養(yǎng)細(xì)胞欣粒如果用50水洗軋 通常情況下可以取10nl洗脫液做Acaroze電泳戒酚切分析.

6、實驗二農(nóng)桿情介導(dǎo)的Ifl物19傳轉(zhuǎn)化（練合設(shè)計實驗-）實驗?zāi)康?. 使芳生全而了解農(nóng)桿繭介導(dǎo)的檢物轉(zhuǎn)基因的方法：2. 使學(xué)生根棚已學(xué)的知識.在教師描導(dǎo)下設(shè)計一個農(nóng)桿菌介導(dǎo)Ifl物的遺傳轉(zhuǎn)化實0方案：3. 使學(xué)生掌握農(nóng)桿菌培養(yǎng).檢初外IJU本無鑿系建立農(nóng)HiStt染和轉(zhuǎn)化體篩選零一系列試笛方祛.（二）焙養(yǎng)基1. LB培養(yǎng)基：每升含羊齊酵母段幵5 s，胰蛋白淼10匕.XaCl 5乙PH 7.22. YB培養(yǎng)基：毎升含有：牛肉浸ff 3 s醇母igff 1 S，蛋白腺5匕岷橢5匕耘S3 H2O 0.5 cPH 7.03. YEPffiM：毎升含有：牛肉浸膏10匕.酵毎捉取液10 sNaCl 3 B

7、. PH 7. 04實生苗培1/2MS培養(yǎng)基.附加3OS和0.6%瓊脂.PH二6.0，3. 預(yù)培養(yǎng)如 MST.0l.2ms L 240. 2m匕I 6BA3g奩橢+6匕瓊盼.PH=5. S6分化培養(yǎng)基：XS*0. 2db/L IAA*2. CmC/L 6-BA-305 能橢*6. 3C 球耶+A品036叱 L PH=5. 8-7.稀選焙養(yǎng)基，分化焙養(yǎng)呈+A匕血3 G=c. L*5CCmC/L Cbl0. L Kan. PH=5. 8.（三）試驗儀話超級趙海L作臺智能氣帳培菲箱大型落地式高速冷棟燙心機凝膠成像系統(tǒng)臺式密溫高速離心機立式滅菌鍋電泳相關(guān)設(shè)備（四）農(nóng)桿肅介導(dǎo)植初轉(zhuǎn)化實崟步屋（以油菜子葉

8、轉(zhuǎn)化為例）1.根癌農(nóng)桿18的焙養(yǎng)將保存于甘油中的菌種用劃線法接種J LB固體平板培養(yǎng)基1：培養(yǎng)每次轉(zhuǎn)化前天從平板I 挑取單甫落接種I-YEB液體垢養(yǎng)基中. 在269, 170r/min的搖床上過夜培養(yǎng).鬥OD600ft達0.305時將八在4000r/Bin的條件下髙心棄去上淸然后用液體MS 培弄基將兀竝込稀樣58倍待用.2 建立無鑿苗將抽菜種子用7MM浸泡30玄后，于畑C12脩液中處理lOoin,無茵水沖洗3次后.樓種Fl/2MSffl體培養(yǎng)基上.在251 黒暗條件下焰養(yǎng)3d.后移至光下培養(yǎng)13d.取梵下胚軸和帶柄子叫接種在預(yù)堵養(yǎng)基上.在25C光P為001*16h光照周期焙 養(yǎng)條件下站養(yǎng).待用.3.農(nóng)ffffltt染在無菌條件下將及培養(yǎng)X子叫和下胚軸收集于一個無創(chuàng)小饒杯中.沒入于活化并/ 5-S倍的農(nóng)桿i液中.后轉(zhuǎn)到無茵 逑紙上.吸T哆余的蔭液.接至共培養(yǎng)培養(yǎng)基中.在25X?生化培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2d.4分化焙養(yǎng)將共站菲2d的受體材料先用無情水沖洗23次至水泓淸后用500=5 LCe泡3010辭n材料IRiUMK于含脊無繭灘紙的培養(yǎng) 中干燥2d.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至附加8-15b/L卡那霉素和50（應(yīng)