陰離子交換色譜對(duì)DNA納米結(jié)構(gòu)的分離純化研究

1、陰離子交換色譜對(duì)DNA納米結(jié)構(gòu)的分離純化研究1 引言DNA 納米結(jié)構(gòu)由于精確可控的幾何外形而在眾多領(lǐng)域有著潛在應(yīng)用1. 與無(wú)機(jī)納米材料相比, DNA納米結(jié)構(gòu)的合成遵循 Watson-Crick 堿基互補(bǔ)配對(duì)原則, 自下而上;制備, 具有很多獨(dú)特的性質(zhì): 尺寸和形狀精確可控、化學(xué)反應(yīng)活性、空間可尋址性等. 迄今為止, 研究者們已經(jīng)成功制備了大小形狀可調(diào)節(jié)、機(jī)械性能各異、表面修飾多樣的二維和三維 DNA 納米結(jié)構(gòu)25, 并實(shí)現(xiàn)了 DNA 納米結(jié)構(gòu)與其他材料的共組裝611. DNA 四面體12是最常見(jiàn)的一種 DNA 納米結(jié)構(gòu), 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單(46 條 ssDNA 組成)、易大量制備、尺寸大小可通過(guò)棱長(zhǎng)調(diào)

2、節(jié), 而且具有多個(gè)可修飾位點(diǎn), 在生物傳感器領(lǐng)域中得到應(yīng)用并表現(xiàn)出了很好的效果13. 此外, DNA 四面體還可以用作載體把蛋白質(zhì)6,7或其他分子運(yùn)送到細(xì)胞或者活體內(nèi)部14,15.近年來(lái), DNA 四面體穿過(guò)細(xì)胞膜的方式及其在胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)耐緩降妊芯恳灿辛送黄菩缘倪M(jìn)展16. 然而, 由于 DNA 錯(cuò)誤折疊等現(xiàn)象存在, 獲得高純度、高產(chǎn)率的DNA納米結(jié)構(gòu)依然是一個(gè)挑戰(zhàn), 成為DNA納米技術(shù)應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題. 因此, 發(fā)展簡(jiǎn)單、高效的純化方法也成為人們關(guān)注的熱點(diǎn).目前, DNA 納米結(jié)構(gòu)純化最常用的方法是凝膠電泳, 包括聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和瓊脂糖凝膠電泳. 盡管電泳方法分辨率很高, 但是存在

3、一些問(wèn)題, 如回收率偏低、規(guī)模小、費(fèi)時(shí)繁瑣且存在 DNA嵌入染料或者凝膠殘余等的污染. 最近 Shih 課題組17首次報(bào)道了使用甘油速率區(qū)帶離心法純化一系列較大的三維 DNA 折紙納米結(jié)構(gòu)的方法. 這種方法主要是利用單體與其各種副產(chǎn)物如聚集體以及原料如訂書釘鏈(staple 鏈)的沉降系數(shù)的不同而進(jìn)行分離,其分辨率較低, 對(duì)于沉降性質(zhì)差別較小的結(jié)構(gòu)分離能力較差, 且對(duì)于較小的 DNA 納米結(jié)構(gòu)也無(wú)能為力.因此建立一個(gè)高分辨率、快速簡(jiǎn)便、可大規(guī)模純化的方法對(duì)于 DNA 納米結(jié)構(gòu)的應(yīng)用非常重要. 本文提出將傳統(tǒng)的高效液相色譜(HPLC)用于DNA納米結(jié)構(gòu)的分離純化的方法.HPLC 是一種經(jīng)典的分離

4、技術(shù), 分辨率高、可以高通量回收、可自動(dòng)化, 廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)領(lǐng)域和生化領(lǐng)域. 最近 HPLC 在納米材料領(lǐng)域也有較多應(yīng)用,已用來(lái)純化量子點(diǎn)18和金納米粒子19等. 陰離子交換色譜(AEC)非常適合于 DNA 的分離純化, 可用來(lái)分離各種 DNA 結(jié)構(gòu), 包括短的單鏈 DNA 和雙鏈DNA, 長(zhǎng)的 PCR 產(chǎn)物和質(zhì)粒 DNA 等. 它的分離原理是在陰離子交換樹脂(固定相)上含有兩種基團(tuán): 固定不動(dòng)的陽(yáng)離子基團(tuán)和可交換的陰離子基團(tuán), 待測(cè)陰離子可與陽(yáng)離子基團(tuán)結(jié)合, 但這種結(jié)合是可逆的, 可被流動(dòng)相中的陰離子交換, 當(dāng)流動(dòng)相陰離子濃度增加到足夠強(qiáng)度時(shí), 待測(cè)陰離子便會(huì)被完全交換下來(lái),從而達(dá)到分離

5、純化的目的. DNA 是一類多陰離子的聚合物, DNA 結(jié)構(gòu)越大, 陰離子越多, 與固定相親和性越高, 這種結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致的性質(zhì)差異可以被 HPLC有效區(qū)分.本文擬用 AEC 方法分離 5 種 DNA 四面體, 棱長(zhǎng)分別為 13 (實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計(jì))、1712、2020、2610和 30 bp15, 依次命名為 TH13、TH17、TH20、TH26和 TH30; 此外, 還制備了 20 bp 棱長(zhǎng)的三角雙錐21,命名為 TB20, 考察 AEC 對(duì) DNA 納米結(jié)構(gòu)的分離效果.2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 試劑與儀器三羥甲基氨基甲烷(Tris base)購(gòu)自 Aladdin(中國(guó)), 純度99.9%; N

6、aClO4H2O 購(gòu)自 Sigma-Aldrich 公司(美國(guó)), 純化等級(jí)為 HPLC 級(jí), 純度99.0%;GelRed DNA 染料購(gòu)自 Biotium 公司(美國(guó)); 其他試劑均從國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司(中國(guó))購(gòu)買. 整個(gè)實(shí)驗(yàn)所用的水為 Milli Q 水, 18 MW cm. MWCO 30 kDa 濾管購(gòu)自 Millipore 公司(美國(guó)); 陰離子交換色譜柱購(gòu)自Thermo Scientific 公司 ( 美國(guó) ), 型號(hào)為 DNAPacTMPA-100 BioLCTM Analytical 4×250 mm; DNA 寡核苷酸購(gòu)自 Invitrogen 公司(美國(guó)),

7、 PAGE 純化, DNA 序列見(jiàn)表 S1 (網(wǎng)絡(luò)版補(bǔ)充材料).紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Hitachi U-3010, 日本);PCR 儀(applied Biosystems Veriti 96 well ThermalCycler, 美國(guó)); HPLC 系統(tǒng): Waters 1525 泵(美國(guó))、Waters 2998 光電二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)); 核酸蛋白質(zhì)微量定量?jī)x(IMPLEN NanoPhotometer P330, 德國(guó)); 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Syngene G:Box Chemi-XL,英國(guó)).2.2 實(shí)驗(yàn)方法2.2.1 DNA 四面體及三角雙錐的自組裝DNA 四面體通過(guò)一步退

8、火來(lái)合成, 將各組分單鏈(46 條), 在 TM 緩沖液(0.01 mol/L Tris-HCl, 0.005mol/L MgCl2, pH 8.0)中等摩爾混勻, 通常 DNA 四面體各鏈終濃度為 1×10-6mol/L, 而 DNA 三角雙錐為1.7×10-7mol/L, 然后在 PCR 儀預(yù)設(shè)程序中退火, 預(yù)設(shè)程序一般為 95加熱 10 min, 迅速冷卻至 4, 在4停留 20 min 后取出樣品, 即完成組裝.2.2.2 陰離子交換色譜(AEC)純化 DNA 四面體及三角雙錐HPLC 所用流動(dòng)相 A 為 0.025 mol/L Tris-HCl,0.375 mol/L NaClO4, pH 8.0; 流動(dòng)相 B 為 0.025 mo