《儀器鑒別法》PPT課件.ppt

1、主講人：沈曉君,第三節(jié) 儀器分析法,有機藥物分子中含有共軛結(jié)構(gòu)，生、助色基團(tuán)而顯示特征吸收光譜，可作為鑒別的依據(jù)。 光譜簡單，專屬性差,1.紫外光譜鑒別法,紫外-可見光區(qū)的波長范圍,200400nm,紫外光譜的特征,吸收峰,吸收峰,谷,谷,末端吸收,常用的方法有： 對比法：測定供試品的吸收光譜或規(guī)定的信息參數(shù)對比；或與對照光譜及特征參數(shù)對比； 測定最大吸收波長，或同時測定最小吸收波長； 規(guī)定一定濃度的供試液在最大吸收波長處的吸收度； 規(guī)定吸收波長的吸收系數(shù)法； 規(guī)定吸收波長的吸收度比值法； 經(jīng)化學(xué)處理后，測定其反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特性。 以上方法可以單個應(yīng)用，也可幾個結(jié)合起來使用，以提高方法的專

2、屬性,測定最大吸收波長，或同時測定最小吸收波長,乙胺嘧啶 供試品在0.1mol/L的介質(zhì)中的紫外吸收在272nm處為峰，216nm處為谷,規(guī)定吸收波長的吸收度比值法,兩性霉素在362nm、381nm、405nm波長處有最大吸收， 規(guī)定：362nm/381nm吸光度比值不大于0.6 381nm/405nm吸光度比值不大于0.9 VB12 361nm/278nm 1.701.88 361nm/550nm 3.153.45,安宮黃體酮(M=386.53,炔諾酮(M=298.43,max=2401nm,max=2401nm,3,3,4,4,規(guī)定吸收波長和吸收系數(shù)法,三種甾體激素的紫外吸收光譜 (10g

3、/ml甲醇溶液,醋酸潑尼松,醋酸氫化可的松,醋酸可的松,與對照品比較，對比吸收光譜的一致性,紫外-可見分光光度計的主要部件,光源：提供能量激發(fā)被測物質(zhì) 單色器：將來自光源的連續(xù)光譜按波長順序色散，并從中分離出一定寬度的譜帶，獲得所需單色光 吸收池：盛放溶液并提供一定吸光厚度 檢測器：檢測光訊號，并將光訊號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娪嵦?訊號處理及顯示器：迅號放大、數(shù)學(xué)換算,專屬性強、應(yīng)用較廣（固體、液體、氣體樣品）。 主要用于組分單一、結(jié)構(gòu)明確的原料藥，特別適合于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、細(xì)微差別同類藥物，如磺胺類、甾體激素類和抗生素類藥品,2.紅外光譜法,鑒別方法：中國藥典和BP(2000）均采用標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照法。 首先測定供

4、試品IR圖譜，然后與標(biāo)準(zhǔn)的對照圖譜比較。Ch.P.制訂有與其配套的藥品紅外光譜集,1）試樣制備方法,壓片法,供試品（約1mg）+干燥KBr/KCl（約200mg,研磨均勻（瑪瑙研缽,置模具中 加壓0.8-1Gpa,均勻透明片 無明顯顆粒 供試片,2-5min,同法制空白KBr/KCl片，做空白校正，扣除背景干擾,糊法,供試品（約5mg），滴加少量液體石蠟或其他液體,瑪瑙研缽,制成糊狀物,取適量 夾于兩KBr片（150mg/片）之間,供試片,KBr片（約300mg），制成空白片，做背景校正,膜法,供試品多為高分子聚合物，可做成液膜鋪展于適宜鹽片上,溶液法,液體供試品（或溶于適宜的溶劑內(nèi)），制成1

5、%-10%的溶液，至于0.1-0.5厚的液體池中，即可測的,2）應(yīng)用光譜圖對照時應(yīng)注意的問題： 1）由于晶型的影響，致使錄制的光譜圖與光譜集所收載的光譜圖不一致，應(yīng)按光譜集中各相應(yīng)光譜圖中備注的方法進(jìn)行預(yù)處理后，再行錄制。 分別按同晶型對照的圖譜比較同質(zhì)異晶現(xiàn)象的藥品,2）采用壓片法時，若樣品（包括鹽酸鹽）與溴化鉀之間不發(fā)生離子交換反應(yīng)，則采用溴化鉀作為制片基質(zhì)。否則，鹽酸鹽樣品制片時必須使用氯化鉀基質(zhì)。 3）測定時應(yīng)注意二氧化碳和水汽（3440cm-1及1630cm-1）等的大氣干擾，必要時，應(yīng)采取適當(dāng)措施（如采用干燥氮氣吹掃，真空）加以改善,4）儀器間分辨率的差異及不同的操作條件（如狹縫程

6、序，掃描速度等）可能影響藥品光譜圖的判斷。 需用在比較樣品的光譜圖前，首先比較聚苯乙烯薄膜的光譜圖。 5）本法對于多組分藥物或存在多晶現(xiàn)象而又無可重復(fù)轉(zhuǎn)晶方法的藥物不適用,色譜鑒別法,利用不同物質(zhì)在不同色譜條件下，產(chǎn)生各自的特征色譜行為（Rf值或保留時間）進(jìn)行鑒別試驗。采用與對照品（或經(jīng)確證的已知藥品）在相同的條件下進(jìn)行色譜分離，并進(jìn)行比較鑒別。常用的方法有,1.薄層色譜法 一般采用對照品（或標(biāo)準(zhǔn)品）比較法，要求供試品與對照品主斑點的顏色與位置應(yīng)一致,2.高效液相色譜和氣相色譜法 一般規(guī)定按供試品含量測定項下的色譜條件進(jìn)行試驗。要求供試品和對照品色譜峰的保留時間應(yīng)一致。 內(nèi)標(biāo)法時，要求藥物與內(nèi)

7、標(biāo)物峰的保留時間比值也應(yīng)相同,液相色譜儀,HPLC流程及主要部件,1.流程,2.主要部件,1) 高壓輸液泵 主要部件之一，壓力：150350105 Pa。 為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。 應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性,2)梯度淋洗裝置,外梯度: 利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱,內(nèi)梯度: 一臺高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合,3) 進(jìn)樣裝置,流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐

8、高壓的六通閥進(jìn)樣裝置， 其結(jié)構(gòu)如圖所示,4) 高效分離柱,柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑16 mm，柱長540 cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效,5) 液相色譜檢測器,a.紫外檢測器 應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。 特點：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm 10mm ，容積 8L）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫,b.熒光檢測器,高靈敏度、高選擇性； 對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng),流動相類別,按流動相組成分：單組分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：固定組

9、成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間,流動相選擇,在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短,常用溶劑的極性順序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六環(huán) 四氫呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 異丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷己烷煤油(最小,水、甲醇、氯仿、正丁

10、醇極性大小,選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題,1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。溶劑需脫氣，過濾,2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等,3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積,4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收,氣相色譜法,氣相色譜法是采用氣體為流動相（載氣）流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測定的色譜方法,注入進(jìn)樣口的供試品被加熱氣化，并被載氣帶入色譜柱進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測器，色譜信號用記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)紀(jì)錄

11、,工作流程示圖,1.載氣瓶 2.壓力調(diào)節(jié)器 3.凈化器 4.穩(wěn)壓閥 5.柱前壓力表 6.轉(zhuǎn)子流量計 7.進(jìn)樣器 8.色譜柱 9.色譜柱恒溫箱 10.餾分收集口(柱后分離閥) 11.檢測器 12.檢測器恒溫箱 13.記錄器 14.尾氣出口,1.儀器分析應(yīng)用數(shù)量增加，尤其是紅外光譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法。 2.制劑廣泛采用IR法鑒別。與原料藥相比，制劑需先分離再壓片繪制圖譜,二、藥物鑒別方法新動向,鑒別試驗必須在規(guī)定條件下完成，否則將會影響結(jié)果的判斷。影響鑒別反應(yīng)的主要因素有被測物濃度，試劑的用量，溶液的溫度、 pH ，反應(yīng)時間和干擾物質(zhì)的存在等,三、鑒別試驗條件,一）反應(yīng)靈敏度和空白試驗

12、 在一定條件下，能在盡可能稀的溶液中觀測出盡可能少量的供試品，反應(yīng)對這一要求所能滿足的程度，即稱為反應(yīng)的靈敏度（sensitivity）。它以兩個相互有關(guān)的量來表示,四、鑒別試驗靈敏度,最低檢出量（又稱檢出限量） （以m表示），就是應(yīng)用某一反應(yīng)，在一定的條件下，能夠觀測出試驗結(jié)果的供試品的最小量，其單位通常用微克（g）表示。 最低檢出濃度（又稱界限濃度），是應(yīng)用某一反應(yīng)，在一定條件下，能夠觀測出供試品的最低濃度，通常以1: V(或1:G）表示，其中V(或G)表示含有1g重某供試品的溶液的毫升（或克）數(shù),影響條件： 1.在選用靈敏度很高的反應(yīng)時，必須采用高純度的試劑，非常潔凈的器皿，才能保證鑒別試驗結(jié)果的