分子生物學考試重點

1、.第二章 原核與真核生物的基因組1.核酸的紫外吸收、定性定量分析DNA和RNA的最大吸收峰為260nmA260/A280: pure dsDNA-1.8 pure RNA-2.0 protein-0.5dsDNA ssDNA/RNA,106 大衛(wèi)星DNA 小衛(wèi)星DNA 微衛(wèi)星DNA第三章 DNA復制1岡崎片段：DNA復制時，一股以53方向的母鏈作為模板，指導新合成的鏈沿5 3合成10002000(100-200)個核苷酸不連續(xù)的小片段稱之為崗崎片段。崗崎片段由DNA連接酶連成一條完整的新鏈。2復制叉：復制時DNA分子中的叉形結構，是由解開的兩條鏈和尚未松解開的雙螺旋形成的，是復制有關的酶和蛋白

2、質組裝成復合物和新鏈合成的部位。 3復制子：能獨立進行復制的DNA 單位，從起始位點到終止位點的全部DNA。4細菌DNA復制的過程（起始），各種酶及蛋白質的作用細菌DNA復制的過程 起始：DnaA 首先結合在OriC位點上的4個9bp重復序列上（共同序列為TTATCCACA）20-40個DnaA 蛋白各帶一個ATP聚集在此位點上，DNA纏繞其上形成的復合物促使左側鄰近的3個成串富含AT的13bp序列被解鏈而成為開鏈，中間復合物所需能量由ATP供給在DanC幫助下，DanB六聚合酶隨即結合于解鏈區(qū)的中間復合物上與其同時，在OriC位點RNA聚合酶參與起始復合物形成，合成一條短的RNA片段，并形成

3、鄰近的OriC位點的RNA環(huán)HU蛋白有利于DNA解旋和形成開放起始復合物DNA沿5 3方向移動解旋，形成前體引發(fā)復合物延伸：前導鏈模板與全酶異二聚體的一個亞單位結合，在引物RNA合成的基礎上繼續(xù)合成DNA，其進行方向與復制叉方向一致后隨鏈分4個步驟:后隨鏈的模板形成回環(huán)，聚合酶異二聚體中的一個亞單位和引發(fā)體與后隨鏈模板結合，準備開始合成引物引物沿53方向合成，引物行進的方向與復制叉方向一致模板鏈的環(huán)不斷擴大，在引物3OH端開始合成DNA片段，合成方向為5 3當DNA新片段合成到距離前一片段的5端僅剩一小空隙時，酶的合成受阻，模板鏈接環(huán)，新合成的片段隨即移動到復制叉行進相反的方向。至此，后隨鏈的

4、一個岡崎片段的合成完成終止：細菌環(huán)狀染色體的兩個復制叉向前推移，最后在終止區(qū)相遇并停止復制。該區(qū)含有多個約22bp的終止子位點。DNA復制所需的蛋白質和酶及其作用: DNA解旋酶 利用ATP供能，解開DNA雙鏈, 可隨復制叉的伸展向前移動。 SSB, 單鏈結合蛋白 穩(wěn)定已被解開的DNA單鏈，阻止復性和保護單鏈不被核酸酶降解。 使單鏈DNA 呈伸展狀態(tài)，無彎曲和結節(jié)，有利于作為模板 DNA 引發(fā)酶 在模板復制的起始部位，以DNA為模板催化互補堿基聚合生成一小段RNA 拓撲異構酶 是一類調節(jié)DNA分子的超螺旋水平，可改變DNA拓撲性質的酶。對DNA分子的作用是既能水解、又能連接磷酸二酯鍵。拓撲異構

5、酶 I: 切開DNA雙鏈中的一股，使DNA在解鏈旋轉中不打結，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)再封閉切口。 同轉錄有關拓撲異構酶 II: 能切斷DNA雙鏈，使螺旋松弛。在ATP參與下，松弛的DNA進入負超螺旋，再連接斷端。同復制有關 引發(fā)體 由多種蛋白質及酶組成,是DNA復制開始所必需的. DNA聚合酶性質 聚合酶聚合酶聚合酶3 5 外切活性+5 3 外切活性+-5 3 聚合活性+ 中+ 很低+ 很高新生鏈合成-+聚合酶 主要是對DNA損傷的修復；以及在DNA復制時切除RNA引物并填補其留下的空隙。聚合酶 修復紫外光引起的DNA損傷。聚合酶 復制的主要聚合酶，還具有3 5 外切酶的校對功能，提高DNA復制的

6、保真性（核心酶）。 DNA ligase (DNA 連接酶) 連接DNA鏈3-OH末端和相鄰DNA鏈5-P末端，形成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。反應需要ATP。 3真核生物DNA聚合酶的種類及作用DNA聚合酶位置細胞核細胞核線粒體細胞核細胞核活性5 3的聚合酶活性;引物酶活性5 3的聚合酶活性5 3的聚合酶活性； 3 5的外切活性5 3的聚合酶活性； 3 5的外切活性,需要PCNA5 3的聚合酶活性； 3 5的外切活性功能引發(fā)修復mDNA 的復制前導鏈和后隨鏈的合成修復4端粒的復制過程 端粒后隨鏈模板的3端和端粒酶所結合的RNA分子的3端通過堿基配對形成DNA-RNA的

7、部分雜交鏈 利用RNA為模板，將dNTP單位逐個加到后隨鏈模板DNA3端 DNA-RNA雜交鏈之間發(fā)生相對滑動，DNA鏈3端和RNA 模板下游3端形成新的堿基配對，并暴露出部分RNA模板序列 端粒后隨鏈模板又繼續(xù)延伸，DNA-RNA雜交鏈之間再次發(fā)生移位和配對，周而復始。 當后隨鏈模板的3端延伸到足夠長時，端粒的3單鏈末端回折成發(fā)夾結構，成為引物，復制后隨鏈的5。5DNA復制的類型及例子(1) 型復制（大腸桿菌）(2)滾環(huán)復制 （真核rRNA的擴增、F因子DNA的轉移、裂解途徑的復制）(3)D環(huán)復制 （線粒體DNA）第四章 DNA損傷與修復1點突變的種類 轉換:嘌呤替代嘌呤(A與G之間的相互替

8、代)、嘧啶替代嘧啶(C與T之間的替代)。 顛換:嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤A T or C T A or GG T or C C A or G2引起DNA損傷的因素 DNA分子的自發(fā)性損傷 . DNA復制中的錯誤 以DNA為模板按堿基配對進行DNA復制是一個嚴格而精確的事件，但也不是完全不發(fā)生錯誤的。 堿基配對的錯誤頻率約為10-110-2. 在DNA復制酶的作用下堿基錯誤配對頻率降到約10-510-6。但校正后的錯配率仍約在10-10左右，即每復制1010（100億） 個核苷酸大概會有一個堿基的錯誤。. DNA的自發(fā)性化學變化 a.堿基的異構互變 b.堿基的脫氨基作用 c.脫嘌呤與脫嘧啶 d.堿

9、基修飾與鏈斷裂物理因素引起的DNA損傷 .紫外線引起的DNA損傷 當DNA受到其最易吸收波長(200260nm)的紫外線照射時，主要是使同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體，相鄰的兩個T、或兩個C、或C與T間都可以環(huán)丁基環(huán)連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體。 .電離輻射引起的DNA損傷 電離輻射損傷DNA有直接和間接的效應： 直接效應是DNA直接吸收射線能量而遭損傷； 間接效應是指DNA周圍其他分子(主要是水分子)吸收射線能量產生具有很高反應活性的自由基進而損傷DNA。 化學因素引起的DNA損傷 .烷化劑對DNA的損傷 a. 堿基烷基化b. 堿基脫落c. 斷鏈d. 交聯(lián).堿基類似

10、物、修飾劑對DNA的損傷 人工可以合成一些堿基類似物用作促突變劑或抗癌藥物，如5溴尿嘧啶(5BU)、5氟尿嘧啶(5FU)、2氨基腺嘌呤(2AP)等。由于其結構與正常的堿基相似，進入細胞能替代正常的堿基參入到DNA鏈中而干擾DNA復制合成。還有一些人工合成或環(huán)境中存在的化學物質能專一修飾DNA鏈上的堿基或通過影響DNA復制而改變堿基序列,例如 亞硝酸鹽能使C脫氨變成U，經過復制就可使DNA上的GC對變成AT對； 羥胺能使T變成C，結果是AT對改成GC對； 黃曲霉素B也能專一攻擊DNA上的堿基導致序列的變化，這些都是誘發(fā)突變的化學物質或致癌劑。 3.DNA修復的方法及作用一、(直接修復) 光活化修

11、復：在可見光照射下，DNA光解酶分解環(huán)丁烷嘧啶二聚體形兩個正常的單體。損傷被直接修復，是無差錯的烷基轉移酶：烷基轉移酶將烷基從DNA鏈鳥嘌呤O6位轉移到酶蛋白本身，并失活。無差錯修復。這是一種適應性反應。單鏈斷裂修復：DNA單鏈斷裂是損傷的一種常見形式，可以通過DNA連接酶的重接而修復。二、(切割修復) 核苷酸切除修復：NER的關鍵特征是對損傷的DNA鏈的兩端進行切割。堿基切除修復：BER可以去除因脫氨基或堿基丟失，無氧射線輻射或內源性物質引起的環(huán)氮類的甲基化等因素產生的DNA損傷。BER是維持DNA穩(wěn)定的重要修復方式，其步驟是N-糖苷鍵水解，從而切除發(fā)生變化的堿基。堿基釋放過程是由DNA糖苷

12、酶催化的。修復各種損傷無差錯修復三、（錯配修復) 用于修復在復制中錯配并漏過校正檢驗的任何堿基?？墒箯椭频谋Ｕ嫘蕴岣?02-103倍。無差錯按模板的遺傳信息來修復錯配的堿基錯配修復可以糾正幾乎所有的錯配。此外對于插入或刪除引起的DNA遺傳信息的改變也有作用。四、(重組修復) a. 復制遇到DNA損傷b. 跳過損傷部位，在下一個岡崎片段的起始位置或前導鏈的相應位置上繼續(xù)復制。c. 從同源DNA母鏈上將相應核苷酸序列片段移至子鏈缺口處d. DNA聚合酶填補母鏈空缺。五、(SOS修復) 細胞DNA受到損傷或復制系統(tǒng)受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現(xiàn)的應急效應。傾向差錯的修復。廣泛存在于原核生物和

13、真核生物中，可能在進化中起重要作用。第五章 原核生物轉錄一、模板鏈或反義鏈: 根據(jù)堿基互補原則指導RNA合成的DNA鏈。編碼鏈或有義鏈: 與mRNA序列相同的那條DNA鏈。二、亞基組分功能核心酶核心酶組裝，啟動子識別核心酶和共同形成RNA合成的活性中心核心酶用于模板的結合核心酶？因子存在多種因子，用于識別不同的啟動子亞基：促使RNApol 與DNA模板鏈結合 前端因子使模板DNA雙鏈解鏈為單鏈 尾端因子使解鏈的單鏈DNA重新聚合為雙鏈亞基：RNA聚合酶的催化中心 亞基：結合兩個鋅離子，參與酶的催化功能。負責酶與模板DNA相結合(充當SSB的作用)。亞基：核心酶與s因子結合轉變?yōu)槿?。啟動子識別

14、中起著關鍵的作用。核心酶的功能：作用于轉錄的延伸過程（終止） 依靠靜電引力與DNA模板結合（蛋白質中堿性基團與DNA的磷酸根之 間） 非專一性的結合（與DNA的序列無關） 結合常數(shù)：1011mol 三、70 promoter -55 to +20: 全酶的結合 -20 to +20: 聚合酶緊密結合 ，防止 DNase的降解 Up to position 40: 最重要 -10 and 35 sequence: 6 bp, 對大腸桿菌基因的起始轉錄最關鍵-10 sequence ：TATAAT: 其功能是: (1) RNA pol緊密結合;(2) 形成開放啟動復合體；酶在此處與DNA結合成穩(wěn)定

15、的復合物，在轉錄方向上解開雙鏈形成開放型起始結構。 (3) 使RNA pol定向轉錄。-35 sequence：TTGACA轉錄效率：1、The 35 sequence : 因子識別的區(qū)域。2、The -10 sequence 對DNA解旋起著重要的作用。3、起始位點周圍的序列影響起始效率。4、最初轉錄的30個堿基控制著RNA聚合酶離開啟動子，使另一聚合酶復合物重新起始轉錄的速率。四、大腸桿菌的轉錄過程 (一) RNA鏈起始1. 啟動子結合：全酶與35序列結合，產生封閉的酶-啟動子二元復合物2. DNA解旋：全酶緊密地結合在-10序列處，模板DNA局部變性，形成開放的啟動子二元復合體3. RN

16、A鏈起始：酶移動到轉錄起始位點，第一個rNTP轉錄開始,因子釋放,形成酶-啟動子-rNTP三元復合體a) RNA聚合酶全酶搜索并結合DNA特異位點b) RNA聚合酶與啟動子形成閉和的啟動子復合體c) 封閉性復合物轉變?yōu)殚_放性復合物d) 酶在起始位點聚合910nt的轉錄物，形成二元復合物e) 啟動子清除，釋放因子，RNA聚合酶變構，蠕動移出啟動子區(qū)域(二) RNA 鏈延伸1) s亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構，與模板結合松弛，沿3 5方向前移； 2) 在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。 3) RNA-DNA形成12bp長的雜交螺旋 4) 轉錄產物RNA沿5 3方向延長(三

17、)RNA鏈終止1) 不依賴因子的終止子/內在終止子 結構：一是形成一個發(fā)夾結構 二是6 8 個連續(xù)的U串(發(fā)夾結構末端)機制：（1）新生RNA鏈發(fā)夾結構形成 （2）RNApol暫停為終止提供了機會 ，6 8個連續(xù)的U串可能為RNApol與模板的解離提供了信號 RNADNA之間的 rUdA 結合力較弱于是： RNADNA解離三元復合體解體 RNApol解離轉錄終止2) 依賴因子的終止子 結構： 發(fā)夾結構末端沒有固定特征 靠與的共同作用而實現(xiàn)終止 通讀： 因子的轉錄終止過程中， RNApol 轉錄了 IR 序列之后，雖發(fā)生一定時間的延宕，但如果沒有 因子存在，則RNApol 會繼續(xù)轉錄。聚合酶能越

18、過終止子繼續(xù)轉錄稱為通讀。第六章 真核生物基因的轉錄一、三種真核生物的RNA酶(分別用于哪些轉錄)TypeLocation位置Transcription product 轉錄產物a-amanitin對-鵝膏蕈堿的敏感性RNA Pol INucleoli核仁Most rRNAs（5.8s,28s 18s）Insensitive不敏感RNA Pol IINucleo-plasm核質hnRNA , snRNAVery sensitive非常敏感RNA Pol IIINucleo-plasm核質tRNAs, 5S rRNA,snRNA and other small RNAsModerately se

19、nsitive中度敏感二、mRNA轉錄起始的過程（型是怎么組裝形成的，各轉錄因子的作用）1、型啟動子的轉錄因子 2、轉錄起始復合物的組裝在TFIIA協(xié)助下，TFIID上TBP首先結合到啟動子核心元件TATA框上，形成動態(tài)的瞬時復合物TFIIB進一步結合到動態(tài)的瞬時復合物上TFIIF和RNA聚合酶II預先結合后，再結合到復合物上TFIIE、TFIIJ和TFIIH進入復合物，使之轉變?yōu)橛谢钚缘霓D錄起始復合物TFIIH的DNA解旋酶活性利用ATP，使起始位點解開更多的DNA雙鏈，TFIIH使RNA聚合酶IICTD磷酸化，使RNA聚合酶II離開啟動子，進入延伸階段。3、 增強子：能從啟動子的上游或下游

20、數(shù)千個堿基處激活轉錄的序列元件第七章RNA加工和核糖核蛋白一、 真核生物mRNA的加工過程1. 5端加帽 用mRNA鳥苷轉移酶以5-5的方向在前體mRNA 5端加上一個7-甲基鳥苷 2. 3端剪切核加尾u 聚腺苷化位點 在前mRNA中存在一個聚腺苷化信號： 5-AAUAAA-3, 并在其后的11-20nt處緊跟著一個5-YA-3 在其下游存在一個富含GU的序列。u 3端剪切及加尾 許多特異性的蛋白質因子識別結合這些序列元件，與前mRNA形成復合物進行剪切 聚腺苷聚合酶將250多個的A殘基加到經剪切的前mRNA的3端。u poly A尾巴的功能 穩(wěn)定mRNA分子，與mRNA的壽命有關 有助于成熟

21、mRNA在細胞質中的翻譯。3. 內含子剪接 I 型內含子的剪接型自我剪接內含子在線粒體基因組中發(fā)現(xiàn)，也存在于極少數(shù)單細胞真核生物(如嗜熱四膜蟲的rRNA)的核基因組中。原核體系中少數(shù)內含子也是型內含子（如T4噬菌體胸苷酸合成酶基因）。 第一步：游離G發(fā)動的轉酯反應, G 的3-OH攻擊內元的 5拼接點第二步：游離外元（左）發(fā)動的轉酯反應,左外元的3-OH 攻擊3拼接點，同時釋放線狀的內元，形成成熟RNA分子兩次轉酯反應是緊密偶聯(lián)的 釋放出的內元可繼續(xù)進行轉酯反應而形成環(huán)狀 類內含子的剪接型內含子在植物和低等真核生物的細胞器基因組中發(fā)現(xiàn)。類內含子的剪接和I類內含子不同，而和核mRNA 內含子的剪

22、切有些相似。但也有不同之處。 核mRNA的剪接l 剪接所需的特異序列5-GU-3 : 5 剪接位點或供體位點5-AG-3: 3剪接位點或受體位點(嘧啶區(qū)): before AG at the 3-end分枝點順序：為Py80NPy87Pu75APy95其中A為百分之百的保守，且具有2-OH。位于嘧啶區(qū)上游的10-40殘基處。l 剪接是一個二步反應分支序列中A殘基上的2-羥基與5剪接位點相互作用形成一個套索結構并釋放出外顯子1.切割3剪接位點，隨后將兩段外顯子連接起來。 Splicing 剪接l 參與剪接的因子 snRNPs: U1, U2, U4, U5 and U6其中RNA成分能與5和3剪

23、接位點及分支點的保守序列堿基互補配對。Other splicing factors核pre-mRNA內含子的剪接過程與型內含子RNA的剪接相似，區(qū)別在于前者由剪接體完成，后者由內含子自我催化完成。 剪接過程：剪接體的組裝： snRNPs 和前體mRNA形成的復合物第一次轉酯：左外顯子、內含子剪切套索 第二次轉酯：exons連接、套索狀內含子釋放 拼接體解體與套索降解同步a) U1 snRNP的5端結合到5剪接位點，形成早期剪接復合體b) U2 結合到分支位點，形成前剪接體復合物。c) U4,U5和U6的復合物結合上去，使內含形成環(huán)狀結構，結果使得外顯子的3端和5端靠近，U1、U4解離，形成過渡

24、態(tài)復合物。 d) 剪接體內結構重排，形成有利于催化剪接反應的構象。4. 甲基化 修飾或加工的最后一個步驟是某些堿基的甲基化。 脊椎動物中最常見的甲基化是在 5-RRACX-3序列中A殘基N6位。二、 外顯子: 真核生物的結構基因上，能夠為特定的蛋白質編碼的DNA序列。 內含子:真核生物的結構基因上，不能為特定的蛋白質編碼的DNA序列。RNA編輯：是指轉錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的加入，丟失或轉換等現(xiàn)象。 三、 原核生物和真核生物rRNA的組成1. 原核生物rRNA 基因的結構E.coli 有7種不同的rRNA操縱子分散在整個基因組中每個操縱子包含一個拷貝的5s rRNA、16s rRNA、2

25、3s rRNA序列。有一到4個編碼tRNA的序列。2、原核生物rRNA 基因結構在基因組內成簇排列，成串重復數(shù)百次集中在核仁內可轉錄間隔區(qū)與非轉錄間隔區(qū)交替排列真核生物的18S、5.8S和28S rRNA基因是串聯(lián)在一起形成一個轉錄本，初始轉錄本為45S前體5S rRNA 是由RNA聚合酶III轉錄不相聯(lián)的基因產生的，而且?guī)缀醪恍枰庸?。第八?遺傳密碼與蛋白質的生物合成1. 同義密碼子：編碼同一種氨基酸的多個密碼子。OFRs 開放閱讀框: Suspected coding regions(潛在的編碼區(qū)), 是從起始密碼子起到終止密碼子間的一段連續(xù)的密碼子區(qū)。擺動假說：在蛋白質生物合成中轉移核

26、糖核酸反密碼子的5位堿基不嚴格的特異性的假說。允許反密碼子的5位(第一位)堿基與信使核糖核酸的密碼子3位(第三位)堿基通過改變了的氫鍵配對(如非G-C、A-U 配對)，從而識別一種以上的密碼子。SD序列：信使核糖核酸(mRNA)翻譯起點上游與原核16S 核糖體RNA或真核18S rRNA 3端富含嘧啶的7核苷酸序列互補的富含嘌呤的37個核苷酸序列(AGGAGG)，是核糖體小亞基與mRNA結合并形成正確的前起始復合體的一段序列。2. 遺傳密碼的特性 通用性 例外：mitochondria(線粒體) and unicellular organisms(單細胞生物) 簡并性 Synonymous c

27、odons(同義密碼子) :編碼同一種氨基酸的多個密碼子。 連續(xù)性：non-spacer, non overlap Start codon : AUG ending condon: UAA、UAG、UGA。 方向性：密碼子的閱讀方向為5-3。 變偶性（擺動性）：密碼子的前兩個堿基相同，決定了其專一性，而第三個堿基可以發(fā)生變化，與反密碼的第一個堿基不嚴格按常見的堿基配對規(guī)律配對。3.起始密碼子：AUG 終止密碼子：UAA、UAG、UGA4.密碼子與反密碼子相互作用 u 密碼子與反密碼子是反向互補配對u 如果5反密碼子堿基被修飾，tRNA通常能跟一種以上的密碼子相互作用。(擺動現(xiàn)象)擺動現(xiàn)象: 密

28、碼子的第三個堿基與反密碼的第一個堿基不嚴格按常見的堿基配對規(guī)律配對的現(xiàn)象。密碼子與反密碼子配對的擺動現(xiàn)象蛋白質合成分為4個步驟：a. 氨基酸的活化b. initiation(起始)-起始tRNA與mRNA結合到核蛋白體上，生成翻譯起始復合物。c. Elongation(延伸)-氨基酸的重復添加d. Termination(終止)-蛋白質多肽鏈的釋放5.起始tRNA于起始氨基酸6.原核生物蛋白質起始步驟如下1. 原核生物中, 起始過程所需的成分 核糖體的大小亞基 mRNA 起始氨酰 tRNA ： fMet-tRNAfMet 三種起始因子 : IF1, IF2, IF 3 GTP、Mg2+起始:(

29、1) 核蛋白體大小亞基分離,IF1和IF3與游離的30S亞基結合(2) 30S亞基利用核糖體結合位點(SD序列) 與mRNA模板結合.(3) IF2與GTP復合物結合到小亞基上(4) 起始tRNA (fMet-tRNAfMet) 進入小亞基的P位，tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對，形成30S起始復合物。(5) IF-1和IF-3解離，GTP水解，IF-2釋放，50S大亞基結合結合到fMet-tRNAfMet-mRNA-30S復合物上，形成70S起始復合物。延伸: 又稱核蛋白體循環(huán) (ribosomal cycle)，是指tRNA轉運氨基酸到核糖體上，以mRNA為模板合成多肽鏈的

30、過程。 每次循環(huán)包括： （1）進位(entrance) ：氨酰tRNA轉運需要EF-Tu 和EF-Ts，并要消耗GTP負載tRNA與EF-Tu 和GTP一起形成復合，與核糖體的A位點結合.釋放的EF-Tu.GDP復合物在EF-Ts因子的作用下可再生。 (2) 成肽(peptide bond formation)：肽鍵形成 50S核糖體亞基的肽酰轉移酶催化兩個相鄰的氨基酸之間形成肽鍵，該反應不需要能量。 P位的fMet-tRNAfmet的?；cA位上的AA-tRNA的氨基成肽鍵。tRNA本身則從P位脫落，使P位空出。轉位（移位）: EF-G和GTP結合到核糖體上，空載tRNA從P位點解離，該步驟

31、需要消耗能量。 肽酰tRNA從A位移到P位，mRNA相對與核糖體移動了一個密碼子。需要延伸因子(EF)：EF-T(EF-Tu，EF-Ts)、EF-G GTP，負載tRNA和70S起始復合物。終止:1.釋放因子RF與終止密碼辨認結合 2.肽鏈與tRNA分離(RF) 3.tRNA、mRNA及RF從核蛋白體脫落u RF1 識別 UAA 和 UAGu RF2 識別 UAA 和UGAu RF3 協(xié)助 RF1 或 RF2 執(zhí)行反應7.真核生物與原核生物蛋白質合成起始的區(qū)別真核生物翻譯起始的特點: 核糖體較大,為； 起始因子比較多； mRNA 5端具有m7Gppp帽子結構 Met-tRNAMet mRNA的

32、5端帽子結構和3端polyA都參與形成翻譯起始復合物； 與原核生物翻譯起始的區(qū)別原核生物中30S小亞基首先與mRNA模板相結合，再與fMet-tRNAfMet結合，最后與50S大亞基結合。而在真核生物中，40S小亞基首先與Met-tRNAMet相結合，再與模板mRNA結合，最后與60S大亞基結合生成80SmRNAMet-tRNAMet起始復合物。第九章 原核生物基因表達調控1.乳糖操縱子的組成結構及調節(jié)機制一、乳糖操縱元的結構(一) 乳糖操縱子的結構 a regulatory gene (調節(jié)基因): Lac I, encode the lac repressor (編碼乳糖阻抑物) 3 st

33、uctural genes (結構基因): Lac Y、 Lac Z、 Lac A 2 control elements(調控元件): Plac（啟動子)、 Olac(操縱基因位點)1. 結構基因lacZ, lacY, lacA 三個結構基因位于同一個轉錄單元中。2. 操縱基因 位于 -5至21這段區(qū)域，和啟動子的右側末端重疊，2628bp 是阻遏蛋白的結合位點。 (回文對稱): 當一條鏈以5到3方向從左向右讀與其互補鏈5到3方向從右向左讀時具有相同的序列。以+11為對稱軸，每邊為兩段各6bp反向重復序列3. 乳糖阻抑物(1) 是由4個相同亞基組成的同源四聚體(2) 具有兩個結合位點：操縱基因

34、結合位點和誘導物結合位點(3) 無誘導物存在時，能阻止基因的轉錄,誘導物通過與阻遏物結合，改變它的構象，使之不能與操縱區(qū)相結合，激活基因轉錄。(4) 阻遏蛋白和DNA的結合能增強RNA聚合酶結合DNA的能力二、乳糖操縱子的調節(jié)機制乳糖操縱元的雙調控系統(tǒng)： (1)受乳糖與阻遏蛋白調控的、可誘導的負調控系統(tǒng); (2)受cAMP與CAP調節(jié)的、可誘導的正調控系統(tǒng)。葡萄糖通過調節(jié)cAMP的合成間接監(jiān)控這一過程。 以此保證大腸桿菌靈活、經濟、有效地適應外界環(huán)境，只有在必需的時候（只有乳糖，沒有葡萄糖）才啟動乳糖操縱子的表達。(一) 負調節(jié)機制1. 無誘導物時，阻抑物與操縱基因結合，阻止轉錄2. Indu

35、ction 誘導誘導物跟乳糖阻抑物結合，改變了阻抑物的構象，使其不能結合到操縱位點上。誘導物和結合于操縱基因上的阻遏物結合，使其從操縱基因上釋放。而不是和游離阻遏物結合，影響阻遏物和DNA結合的平衡。誘導物改變阻遏蛋白在DNA上的分布，而不是產生游離阻遏蛋白：n 隨機DNA序列和阻遏蛋白也具有親和力，但比操縱基因和阻遏蛋白的親和力低107倍n 誘導物和阻遏蛋白結合時，阻遏蛋白和操縱基因的親和力下降，所有阻遏蛋白結合在DNA的隨機序列上n 除去誘導物后，阻遏蛋白恢復活性，從隨機位點直接轉移到操縱基因上Lactose (allolactose) ：天然的誘導物IPTG(異丙基-b-D-硫代半乳糖苷

36、), 人工合成的誘導物，, 能快速激活乳糖操縱子結構基因的轉錄，但自身不被分解(義務誘導物) 可誘導調控的操縱元，其基因表達產物都是利用某種營養(yǎng)物的酶體系（分解代謝） 有營養(yǎng)物 相應基因開放 無營養(yǎng)物 細胞就沒必要產生相應的酶 （二） CAP的正性調節(jié)作用DNA結合區(qū)與CAP位點結合CAP(同二聚體),含 cAMP結合區(qū) cAMP-CAP復合物（有活性）1. CRP，cAMP受體蛋白 CRP 是一種轉錄激活因子(分解代謝激活蛋白,CAP) 與cAMP結合后才有活性：CAP與cAMP結合后，發(fā)生空間構象的變化而活化，能以二聚體的方式與特定的DNA序列結合，從而增強RNA聚合酶的轉錄活性，可使轉錄

37、提高50倍 cAMP 水平受 葡萄糖調節(jié) CRP 激活因子參與分解代謝操縱子對葡萄糖水平反應的基因表達的全局調控。cAMP：Cyclic AMP ATP在腺苷酸環(huán)化酶的作用下轉變成環(huán)腺苷酸 (cAMP)。 When glucose is present當葡萄糖存在時，細胞中cAMP含量低，CRP以二聚體的形式存在，從而不能跟DNA結合調控轉錄。當葡萄糖缺乏時，cAMP含量升高，與CRP結合；CRP-cAMP復合物結合到啟動子中RNA聚合酶結合位點上游的序列，使DNA彎曲90 ，增強了RNA聚合酶跟啟動子的結合，使轉錄提高了50倍。 (三) 協(xié)調調節(jié)(1)當阻遏蛋白封閉轉錄時，CAP對該系統(tǒng)不能

38、發(fā)揮作用(2)如無CAP存在，即使沒有阻遏蛋白與操縱序列結合，操縱子仍無轉錄活性。 cAMPCAP復合物與啟動子區(qū)的結合是轉錄起始所必需的。(3)單純乳糖存在時，細菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在時，細菌首先利用葡萄糖。(4)葡萄糖對 lac 操縱子的阻遏作用稱分解代謝阻遏(catabolic repression)。 2.色氨酸操縱子的組成結構及調節(jié)機制。 編碼色氨酸合成所需的5種結構基因 當細胞中色氨酸短缺時，這些基因協(xié)同表1. 特點:(1) trpR和trpABCDE不連鎖；(2) 操縱基因在啟動子內(3) 有衰減子(attenuator)/弱化子(4) 啟動子和結構基

39、因不直接相連，二者被前導序列(Leader)所隔開 (一) 負調控機制 調節(jié)基因 trpR編碼色氨酸阻抑物 與色氨酸形成復合物后，與操縱基因相結合，阻止結構基因的轉錄 Trp ：協(xié)同抑制因子 ，能抑制色氨酸的合成(負反饋調控) 能使轉錄的起始效率下降70倍 是一種 粗調控機制，調節(jié)轉錄的起始色氨酸阻抑物The repressor is a dimer (二聚體) of two subunits which has a structure with a central core (中心區(qū)域) and two flexible DNA-reading heads (DNA解讀頭部) (carbox

40、yl-terminal of each subunit )(二) 弱化系統(tǒng)在高濃度色氨酸存在下，通過形成特殊的“衰減子”結構，對轉錄進行更精細的調控。1. 前導RNA的結構 在trp mRNA5端trpE基因的起始密碼前一個長162bp的mRNA片段。含有四個互補序列區(qū)，堿基互補形成不同的結構2. 前導肽前導RNA含有一個有效的核糖體結合位點，并能編碼一個由14個氨基酸組成的前導肽 該前導序列的第10個和11個密碼子編碼色氨酸。3. 弱化子： DNA中可導致轉錄過早終止的一段核苷酸序列（123-150區(qū)）。u characteristic 位于前導序列(在trpE起始密碼子之前)的末端 非r依

41、賴型的終止位點，有一富含GC的回文對稱結構，緊跟著一串8個U殘基序列 高效的轉錄終止子3. 弱化作用當色氨酸濃度低時，生成的tRNAtrp就少，核糖體在序列1的trp密碼子處暫停，序列2和3之間形成配對結構，阻止了衰減，因為序列3不再與序列4之間形成衰減結構，RNA聚合酶得以沿DNA前進，繼續(xù)去轉錄其后trpE等基因，trp操縱元就處于開放狀態(tài)。當色氨酸濃度增高時，tRNAtrp濃度隨之升高，核糖體快速翻譯序列1(前導肽閱讀框)，占據(jù)到2的機會增加，1和2生成發(fā)夾結構的機會減少，3和4形成類似終止子的衰減子結構的機會增多，導致RNA聚合酶終止轉錄。衰減作用的重要性: 細菌通過弱化作用彌補阻遏作

42、用的不足，因為阻遏作用只能使轉錄不起始，對于已經起始的轉錄，只能通過弱化作用使之中途停下來。阻遏作用的信號是細胞內色氨酸的多少；弱化作用的信號則是細胞內載有色氨酸的tRNA的多少。它通過前導肽的翻譯來控制轉錄的進行，在細菌細胞內這兩種作用相輔相成，體現(xiàn)著生物體內周密的調控作用。3.弱化子：DNA中可導致轉錄過早終止的一段核苷酸序列（123-150區(qū)）。4. 正調控系統(tǒng)和負調控系統(tǒng)1)根據(jù)操縱子對調節(jié)蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的應答，可分為： a.正轉錄調控：如果在沒有調節(jié)蛋白質存在時基因是關閉的，加入這種調節(jié)蛋白質后基因活性就被開啟，這樣的調控正轉錄調控。 b.負轉錄調控: 在沒有調節(jié)蛋白質

43、存在時基因是表達的，加入這種調節(jié)蛋白質后基因表達活性便被關閉，這樣的調控負轉錄調控。2)根據(jù)操縱子對某些能調節(jié)它們的小分子的應答，可分為可誘導調節(jié)和可阻遏調節(jié)兩大類： a.可誘導調節(jié)：指一些基因在特殊的代謝物或化合物的作用下，由原來關閉的狀態(tài)轉變?yōu)楣ぷ鳡顟B(tài)，即在某些物質的誘導下使基因活化。 例：大腸桿菌的乳糖操縱子 分解代謝蛋白的基因b. 可阻遏調節(jié)：基因平時是開啟的，處在產生蛋白質或酶的工作過程中，由于一些特殊代謝物或化合物的積累而將其關閉，阻遏了基因的表達。 例：色氨酸操縱子 合成代謝蛋白的基因3) 在負轉錄調控系統(tǒng)中，調節(jié)基因的產物是阻遏蛋白（repressor），起著阻止結構基因轉錄的作用。 根據(jù)其作用特征又可分為負控誘導和負控阻遏： 在負控誘導系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應物（誘導物）結合時，結構基因轉錄； 在負控阻遏系統(tǒng)中，阻遏蛋白與效應物（輔阻遏物）結合時，結構基因不轉錄。4) 在正轉錄調控系統(tǒng)中，調節(jié)基因的產物是激活蛋白（activator）。 根據(jù)激活蛋白的作用性質分為正控誘導和正控阻遏 在正控誘導系統(tǒng)中，效應物分子（誘導物）的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)； 在正控阻遏系統(tǒng)中，效應物分子（輔阻遏物）的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。第十