WesternBlottingProtocol 中山大學(xué)參考

1、Western BlotingWestern Bloting （張雪雁）操作步驟:1. 做膠：下層膠7.5ml 塊，以水或乙醇隔離空氣。待下層膠凝固后做上層膠，每塊膠配置3ml,灌膠、 插梳子，趕走氣泡。2. 蛋白變性：在膠凝固過程中，變性蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的上樣量按事先所測弄濃度計算準確，分裝到 EP 管或，按5ul/100ul樣品的濃度加B巰基乙醇，然后以PCR儀95C變性10分鐘。3. 上樣、電泳：1）上層膠為安全凝固（大約 15分鐘）后，兩只手同時向上用力取下梳子。以蒸餾水仔細清洗 各泳道內(nèi)殘留得碎膠。2） 將SDS-PAGE交轉(zhuǎn)移到電泳槽中，如果只做一塊膠，對面以玻璃板平衡。1x電泳緩沖

2、液充 滿電泳槽后，以玻璃棒將電泳槽中的氣泡盡量趕除。3）先以少量加有溴酚藍1 x上樣緩沖液標(biāo)記各泳道。4） 變性過的各管蛋白質(zhì)樣品以加有溴酚藍 1x上樣緩沖液補齊至50ul。蛋白Marker也補齊至 50ul。5）以一定順序?qū)⒌鞍讟悠泛?Marker，用微量移液器加至泳道。上樣過程中，手要穩(wěn)，避免將泳道劃破，樣品自槍頭打出時要緩慢，以免樣品自泳道飄出。剩余未加樣的泳道以50ul上樣緩沖液平衡。6） 加樣完畢，紅對紅，黑對黑將電泳槽和電泳儀接好，打開電源，電壓調(diào)至60-100V之間。一 般來說樣品在上層膠時電壓可稍高，進入下層膠后較低的電壓容易將個分子量蛋白粉理清楚。溴酚藍自膠內(nèi)跑出后電泳結(jié)束。

3、4. 電轉(zhuǎn)：1） 準備PVDF膜及濾紙。PVDF大小8.2 x 55.5，濾紙按電轉(zhuǎn)海綿大小剪，一塊膠準備四張濾 紙。2）將PDVRI置于干凈的容器中，倒入適量甲醇浸泡 13分鐘，然后浸泡于電轉(zhuǎn)浸泡液中。3）小心取出兩層玻璃之間的膠，切去上層膠。在電轉(zhuǎn)液中完成如下：電轉(zhuǎn)孔板黑色面鋪放海綿 一張，依次鋪放濾紙兩張，膠一塊，PVDRI 一張，濾紙再兩張，海綿再一張，然后小心扣好 孔板，將其黑色面對黑色面扣入電轉(zhuǎn)架，將電轉(zhuǎn)架放入電泳槽。電泳槽內(nèi)置小冰盒一個，整個電泳槽置于大冰盒中4）接好電源，按蛋白分子量大小調(diào)整電壓。一般小分子量適合低電壓，大分子量適合高電壓。5封閉：1）電轉(zhuǎn)完畢后取出PVDF膜，

4、置于5%勺脫脂奶溶液中封閉。一小時或者 4C過夜。2）一抗反應(yīng)：將抗體以10ml 5%脫脂奶適合稀釋，將PVDF膜浸入其中，置于脫色搖床上促進反應(yīng) 1小時。表達豐度低的蛋白可適當(dāng)加長時間，比如4C冷庫過夜。6回收抗體。7.TBST液搖洗膜，15分鐘x 3次&二抗反應(yīng)：相應(yīng)二抗以1: 2000比例稀釋至10ml。PVDF膜置于其中要洗40 50分鐘。9.TBST液洗膜，15分鐘x 3次10暗房發(fā)光洗片。所需物品：濾紙，保鮮膜，壓片盒，X光片，小鑷子，1000ul移液器，槍頭，配制發(fā)光液，solution I： solution n =1:1，一張膜需要 2ml。1）用紙吸干PVDF膜水分，在保鮮

5、膜上浸泡于發(fā)光液 1分鐘，期間用鑷子翻轉(zhuǎn)幾次促進均勻反應(yīng)。用紙吸干PVDF膜上剩余的發(fā)光液，裹于干凈的保鮮膜里，只需一層。2）PVDF膜平鋪于壓片盒，關(guān)燈，取X光片12張鋪與其上，扣緊壓片盒。根據(jù)需要定制曝光時間。一 般第一張15分鐘。將剩余X光片密封避光保存妥善。3）取出壓片盒中X光片投入自動洗片機中沖洗。Western Bloting 相關(guān)試劑:Acrylamide / Bisacrylamide30%(w/v) acrylamide(丙烯酰胺)(Bio-Rad161-0101)0.8%(w/v) methelenebisacrylamide (N-N亞甲基雙丙烯酰胺)(Gibco155-

6、16-024)丙烯酰胺(Acr)29g亞甲基雙丙烯酰胺(Bic )1g超純水至100ml37 C 下溶解后，4C brown bottle保存，使用時恢復(fù)至室溫且無沉淀。4x Lower Tris 500mlTris base(1.5M,m.w.121.1)90.83g10%SDS20ml超純水至500mlPH to 8.8 (about HCL 12ml)4x Upper Tris, 200mlTris base(0.5M)12.12g10%SDS8ml超純水至200mlPH to6.8 (about HCL 8ml)(Bio-Rad 161-0800)10%Ammonium Persulf

7、ate(過硫酰胺，APS, 10% , W/V)總量 10mlAmmon ium Persulfate1gDH0to 10ml溶解后，分裝后-20 C保存，每次用一支(200ul),保存時間為一周Temed:2 x Sample Buffer,50mlf Glycerol10ml20% SDS15ml4 x Upper Tris12.5mli H2Oto 50ml1 x Sample Buffer1.5ml2 ml3 ml4 ml5 ml10 ml20 ml 50 mlH2O (ml)0.6750.91.351.82.254.5922.52x S.B.(ml)0.7511.522.551025

8、BME (ul)751001502002505001000250010 x Running Buffer4L2L1LGlyci ne(sigmaG 7526)576g288g144gTris base(GIBCOBRL 15504-038)120g60g30gSDS (GIBCOBRL 15525-017)40g20g10g加dH2O至相應(yīng)的容量1 x Running Buffer10x Running Buffer 和dH2O按1:9比例配置，溶解后室溫保存；溶液可置于4C重復(fù)使用3次10 X Transfer Buffer4L2L1LGlyci ne (sigmaG 7526)580g29

9、0g145gTris base(GIBCOBRL 15504-038)116g58g29g加dH2O至相應(yīng)的容量1X Transfer Buffer,2000mldH 2O1400ml;20% metha nol(甲醇)400ml1 X Tran sfer Buffer200ml混勻。溶解后室溫保存；溶液可置于 4C重復(fù)使用3次10X TBS(PH 7.6)1L4L2LTris96.8g48.4g24.2gNacl320g160g80g36%HCL5058ml1 X TBS-T,2000mldH 2O1800ml1X TBS200ml吐溫-202ml（或20%溫10ml）（臨時加入），混勻。1

10、X TBS緩沖液（可參考）1mol/LTris HCL(PH 7.5)10mlNaCl8g蒸餾水至1000ml10X PBS4L2L1LNacl320g160g80gKCL8g4g2gNazHPQ57.6g28.8g14.4gKHPQ9.6g4.8g2.4g加dH2O至相應(yīng)的容量0.01mol/L PBS 緩沖液(ph 7.2-7.4)(可參考)0.2mol/L NaH 2PQ19ml0.2mol/L Na 2HPQ81ml蒸餾水至2000mlStripping Buffer10ml50ml100ml200ml500ml1mol/v Tris HCL(PH 6.7)(ml)0.6253.125

11、6.2512.531.2510%SDS(ml)210204010014.4 mol/lB -巰基乙醇0.070.350.71.43.5dH 2Q(ml)*7.305*36.525*73.5*146.1*365.25*加 dH2Q至相應(yīng)的容量。B -巰基乙醇在Strip前臨時加入。配置時，在通風(fēng)廚內(nèi)進行。4C保存，可重復(fù)使用1次（Stripping 步驟：用Stripping Buffer在50C洗膜10min,之后于室溫下在 TBST中洗膜3次，每次10mi n.封閉后開始加相應(yīng)抗體）附：其他部分試劑配制:母液1mol/LTris HCL13Tris(MW121.14)30.29g蒸餾水200

12、ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)PH至所需點(如下所示)保存。PHHCL7.4約17ml7.5約16ml7.6約15ml8.0約 10ml最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下1.74mg/ml(10mmol/l)PMSFPMSF0.174g;異丙醇100ml溶解后，分裝于1.5ml離心管中，一20T保存0.2mol/l NaH2PO4NaHPQ(MW119.98)12g蒸餾水至500ml溶解后，咼壓火菌，室溫保存。0.2mol/l Na2HPO4NaHPQ 12HQ(MW358.14)71.6g蒸餾水至1000ml溶解后，咼壓火菌，室溫保存。10%SDSSDS10g蒸餾水至100ml50C水浴

13、下溶解，室溫保存。如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10%過硫酸胺(AP)過硫酸胺0.1g超純水1.0ml溶解后，4C保存，保存時間為一周。Tris HCL(PH8.8)Tris (MW121.1415.13g超純水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)PH至 8.8，最后用超純水定容至250ml,高溫滅菌后室溫下保存。0.5mol/l Tris HCL ( PH 6.8)Tris(MW121.14)15.14g超純水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)PH至6.8，最后用超純水定容至250ml,高溫滅菌后室溫下保存。20%Tween2020ml100mlTween20蒸餾水至混勻后，4C保存使用液

14、單去污劑裂解液(50mol/l Tris HCL( PH8.0 ), 150mmol/l NaCL, 1%TritonX-100, 100ug/l PMSF :1mol/l Tris HCL( PH 8.0)2.5mlNaCL0.438gTritonX-1000.5ml蒸餾水至50ml混勻后，4C保存。使用時，加入 PMSFS終濃度為 100ug/ml(0.87ml 裂解液加入 1.74mg/ml PMSF50ul)。G250考馬斯亮藍溶液(測蛋白含量專用)考馬斯亮藍G250100mg95%L 醇50ml磷酸：100ml蒸餾水至1000ml配制時，先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和水，混

15、勻后，用濾紙過濾，4C保存0.15mol/l NaCINaCL(MW58.44)蒸餾水至咼溫滅菌后，室溫保存。0.877g100ml100mg/ml牛血清白蛋白(BSA)BSA0.1g0.15mol/l NaCl1ml溶解后，-20 C保存。制作蛋白標(biāo)準曲線時，用 0.15mol/l NaCL進行100倍稀釋1mg/ml, ，-20 C保存還原型5XSDS上樣緩沖液(0.25mol/l Tris ?HCL(PH 6.8)，0.5mmol/l 二硫叔糖醇，10%SDS,0.5%溴酚藍，50%t油)0.5mol/l Tris ?HCL( PH 6.8)2.5ml0.5mmol/l 二硫叔糖醇0.3

16、9gSDS0.5g溴酚藍0.025甘油2.5ml混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4C保存10X麗春紅染液麗春紅S2g三氯乙酸30g磺基水楊酸30g蒸餾水至100ml使用時將其稀釋10倍。封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液）脫脂奶粉2.5gTBST50ml溶解后4C保存。使用時，恢復(fù)室溫，用量以蓋過膜面即可，一次性使用顯影液（5X）自來水（50r60C)700ml（以下藥品按順序加入前者溶解后再加后者）硫代硫酸鈉240g亞硫酸鈉（無水）15g冰乙酸12.6ml硼酸7.5g鉀明磯15g(水溫冷至30 C以下再加入）加水定容至1000ml，室溫保存。Western Blotting 配膠6%S

17、speratio n Gel7.5% sperati on Gel15%Ssperati on GelStacki ng Gel5ml 10ml15ml20ml75mol2ml4ml5ml8ml30mlAcry1(ml)2.557.51037.5Acry1(ml)0.220.440.660.88 3.3L.T. (ml)1.252.53.75518.75U.T. (ml)0.511.527.5HO(ml)1.232.455.206.9326.00HbO(ml)1.282.563.845.1219.2APS(ul)26.753.380106.7400APS(ul)20406080300Temed

18、(ul)2.55.17.610.138Temed(ul)5101520755ml 10ml 15ml 20ml 75mol5ml 10ml 15ml 20ml 75molAcry1(ml)123415L.T. (ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)2.725.438.1510.8740.75APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.138Acry1(ml)1.252.53.75518.75L.T. (ml)1.252.53.75518.75HzO(ml)2.474.937.49.8737APS(ul)26.753.380106.7400Temed(ul)2.55.17.610.13389%Ssperatio n Gel10.5% sperati on Gel5ml 10ml 15ml 20ml 75mol5ml 10ml 15ml 20ml 75molAcry1(ml)1.534.5622.5L.T. (ml)1.252.53.75518.75H2O(ml)2.724.46.68.833APS(ul)26.753.380106