細(xì)菌內(nèi)毒素檢查驗證方案

1、.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查驗證方案文件編號：VP-QC-2015-06起 草 人： 審 核 人： 批 準(zhǔn) 人： 批準(zhǔn)日期： 年 月 日目錄1 概述.12 驗證目的及范圍.13 驗證小組人員組成及職責(zé).14 驗證依據(jù).25 驗證前準(zhǔn)備.26 驗證的實施.27 偏差處理.58 驗證數(shù)據(jù)及評估.59驗證報告及評審.510 再驗證及周期.511 驗證文件及歸檔.512 附件.51 概述 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑來檢測或量化由格蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查報告兩種發(fā)放，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法，供試品檢測時，可使用其中

2、任何一種方法進行實驗。公司自行制備的注射用水需進行細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，本方案將采用凝膠法進行試驗。2 驗證目的和方法本驗證方案適用于注射用水的細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查，通過對鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗、干擾試驗及凝膠限度試驗，建立該產(chǎn)品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，并對其有效性進行評價，確保檢測方法的專屬性、靈敏度，保證檢測結(jié)果可符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。3.驗證小組人員組成及職責(zé)：3.1驗證小組由以下部門人員組成：質(zhì)量部、QC、生產(chǎn)部。3.2 驗證小組組成及職責(zé)列表組成職 責(zé)QC1. 負(fù)責(zé)起草驗證方案的起草2. 負(fù)責(zé)本方案的培訓(xùn)3. 儀器儀表校驗確認(rèn)4. 負(fù)責(zé)驗證的實施5. 負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的收集和整理6. 負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析7. 負(fù)責(zé)

3、完成驗證報告質(zhì)量部1. 負(fù)責(zé)驗證方案、驗證報告的審核與批準(zhǔn)2. 負(fù)責(zé)驗證現(xiàn)場的監(jiān)督審查生產(chǎn)部1. 負(fù)責(zé)保障設(shè)備、器具的完好2. 負(fù)責(zé)動力系統(tǒng)的保障4 驗證依據(jù) 中華人民共和國藥典2015版 1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法5.驗證前準(zhǔn)備5.1驗證人員培訓(xùn)：驗證報告起草人有責(zé)任在方案批準(zhǔn)后（且在驗證實施前）對本次驗證相關(guān)人員進行培訓(xùn)。培訓(xùn)人員記錄見附件1。5.2 確認(rèn)儀器儀表設(shè)施經(jīng)過確認(rèn)和校驗，并填寫確認(rèn)記錄。5.3 相關(guān)文件，確認(rèn)以下文件皆為現(xiàn)行有效版本。序號相關(guān)文件文件編號1DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱操作規(guī)程WI-1002BSC-100-II-B2生物安全柜操作和維護保養(yǎng)規(guī)程WI-1013WXQI

4、-S-18SI自動手提式滅菌器使用和維護保養(yǎng)規(guī)程WI-1034DK型電熱恒溫水浴鍋操作規(guī)程WI-1045HWS型恒溫恒濕箱操作規(guī)程WI-1056JA2003N電子天平操作及維護保養(yǎng)規(guī)程WI-1067PHS-3C型PH計操作及維護保養(yǎng)規(guī)程WI-1088SHP-3C型低溫生化培養(yǎng)箱操作及維護保養(yǎng)規(guī)程WI-1099YJ-875SDB型凈化操作臺的操作及維護保養(yǎng)規(guī)程WI-11310培養(yǎng)基管理規(guī)程WI-766 驗證的實施6.1實驗材料及用具6.1.1電子天平6.1.2. 電熱干燥箱6.1.3. 恒溫恒濕箱6.1.4.水銀溫度計6.1.5. 旋渦混合器6.1.6. 鱟試劑（具有國家主管部門的批準(zhǔn)文號）6.

5、1.7.細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(由中國藥品生物制品檢定所統(tǒng)一發(fā)放的標(biāo)準(zhǔn)品)6.1.8.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：應(yīng)符合滅菌注射用水標(biāo)準(zhǔn)，其內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml，且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用。6.1.9. 實驗用具:移液管、凝集管、三角瓶、試管、試管架、洗耳球、時鐘、75%酒精棉、剪刀、砂輪。6.2實驗準(zhǔn)備 6.2.1玻璃器皿的洗滌將玻璃器皿放入鉻酸洗液或其他熱原滅活劑或清洗液中充分浸泡，然后取出將洗液空干，用自來水將殘留洗液徹底洗凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗三遍以上，空干后放入適宜的密閉金屬容器中或用錫箔紙包好后再放入金屬容器內(nèi)，放置入烤箱。6.2.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素玻璃器皿

6、置烤箱后，將烤箱調(diào)至250，待烤箱溫度升至設(shè)定的溫度后開始計時，干烤至少1 小時。達到規(guī)定時間后，關(guān)斷電源，待烤箱溫度自然降至室溫。在不打開金屬容器的情況下，可在兩天內(nèi)使用；如果玻璃器皿用錫箔紙包裝，在不打開包裝的情況下可在兩周內(nèi)使用，否則須再次干烤除去可能存在的外源性內(nèi)毒素。6.3鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗 本試驗采用凝膠法，凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理進行限度檢測的方法。6.3.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，啟開過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。按照標(biāo)準(zhǔn)品說明書，加入規(guī)定量的細(xì)菌

7、內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋，制備成4個濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，即2、0.5、0.25（為所復(fù)核的鱟試對的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30 秒鐘。6.3.2 待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/ 支的鱟試劑18支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml 檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。6.3.3.加樣將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支（管）放在試管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4 支（管）

8、4 列每列每支分別加入0.1ml 的2、0.5、和0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；另2支（管）加入0.1ml檢查用水，作為陰性對照。6.3.4 加樣結(jié)束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，垂直放入試管架上，連同試管架放入371恒溫恒濕箱中，試管架保持水平狀態(tài)，保溫602 分鐘。6.3.5 觀察并記錄結(jié)果。將試管架從恒溫恒濕箱中輕輕取出，避免振動，將每管拿出緩緩倒轉(zhuǎn)180觀察，管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽性，記錄為（+）；未形成凝膠或凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（）。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動，造成假陰性結(jié)果。6.3.6實驗結(jié)果計算如最大濃度

9、24管均為陽性，最低濃度0.254管均為陰性，陰性對照為陰性時實驗為有效，按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果（c）。 c = lg-1 (X/4)式中x為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點濃度是系列遞減的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。6.3.7結(jié)果判斷6.3.7.1.判斷標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)c在0.52（包括0.5和2）時判定該批鱟試劑靈敏度復(fù)核合格，可用于干擾實驗和供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以（標(biāo)示靈敏度）為該批鱟試劑的靈敏度。6.3.7.2 判斷結(jié)果：（記錄附后） 6.4干擾實驗6.4.1目的是檢驗本公司自制的注射用水對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用。使用的供

10、試品溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過所使用的鱟試劑的最大有效稀釋倍數(shù)的溶液。6.4.2 確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）注射用水的內(nèi)毒素限值L為0.25EU/ml，鱟試劑的標(biāo)示靈敏度為0.25 EU/ml，則最大有效稀釋倍數(shù)MVD為注射用水本身濃度。公司如下： MVD=cL/ 式中：L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值 c為供試品溶液濃度 為鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值。6.4.3制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液取1支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即2、0.5、0.25（方法同6.3.1）。6.4.4 制備含內(nèi)毒素的供試品溶液再注射用水將6.4.3.中的同支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個濃度即2、

11、0.5、0.25的含內(nèi)毒素的供試品溶液。6.4.5鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑28支，輕彈壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。6.4.5加樣：按下列表1方法進行加樣1) 將準(zhǔn)備好的鱟試劑取其中18支（管）放在試管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2.0、1.0、0.5、0.25的含內(nèi)毒素的供試品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為陰性對照。2) 將另外10支（管）鱟試劑放在試管架上

12、，排成5列，每列2支（管）。其中的4列每列每支分別加入0.1ml的含2.0、1.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為樣品陰性對照。加樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，連同試管架放入371恒溫恒濕箱中，保溫602分鐘后，觀察并記錄結(jié)果。表1 凝膠法干擾試驗溶液的準(zhǔn)備編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2l/供試品溶液供試液溶液12l421l440.5l480.25l4C2l/檢查用水檢查用水12l221l240.5l280.25l2D無/檢查用水2注：A為供試品溶液；B

13、為干擾試驗系列；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。6.4.7實驗結(jié)果計算只有當(dāng)溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果符合鱟試劑里面的復(fù)核試液要求時，試驗方為有效。當(dāng)系列溶液B的結(jié)果符合鱟試劑里面的復(fù)核試驗要求室，認(rèn)為該供試品溶液物干擾作用。其他情況則認(rèn)為供試品溶液存在干擾作用。按下式計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Es)和用供試品溶液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Et).Es= lg-1 (Xs/4)Et= lg-1 (Xt/4)Xs、Xt分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值

14、（lg）。6.4.8結(jié)果判斷6.4.8.1判斷標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)Es在0.52.0（包括0.5和2.0）時，且Et在0.5 Es2.0Es（包括0.5 Es和2.0Es）時，則認(rèn)為該供試品溶液不干擾實驗，可對此供試品進行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。當(dāng)Et不在0.5 Es2.0Es（包括0.5 Es和2.0Es）時，則認(rèn)為該供試品溶液干擾實驗。6.4.8.2判斷結(jié)果：（記錄附后） 。6.5供試品的凝膠限度試驗檢查6.5.1 在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照，同時每次實驗必須做2支陽性對照和2支陰性對照。6.5.2 凝膠限度溶液的制備：按表2進行各試驗溶液的制備表1 凝膠限度試驗溶液的

15、制備編號內(nèi)毒素濃度/被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2l/供試品溶液2C2l/檢查用水2D無/檢查用水2 注：A為供試品溶液；B為供試品陽性對照；C為陽性對照；D為陰性對照。6.5.2.1 供試品溶液的制備：取公司自制的注射用水，不需進行稀釋處理。6.5.2.2陽性對照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制成2濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液（方法同6.3.1）。6.5.2.3供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。（方法同6.4.4制備含內(nèi)毒素的供試品溶液）。6.5.2.4陰性對照液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水6.5.3鱟試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/支

16、的鱟試劑8支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用砂輪在瓶頸輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開備用，防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。每支加入0.1ml檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。6.5.4 加樣取8支（管）溶解好的鱟試劑，其中2支（A）加入0.1ml供試品溶液作為供試品管，2支（B）加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管，2支(C)加入0.1ml陽性對照溶液作為陽性對照管，2支(D)加入0.1ml檢查用水作為陰性對照管。6.5.5 將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入371恒溫恒濕箱中，保溫602分鐘。保溫和取放試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。6.5

17、.6結(jié)果判斷6.5.6.1判斷標(biāo)準(zhǔn)若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。若溶液A的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，一管為陰性，需進行復(fù)試。復(fù)試時溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規(guī)定，否判定供試品不符合規(guī)定。6.5.6.2 判斷結(jié)果：（記錄附后） 7.偏差處理驗證的數(shù)據(jù)產(chǎn)生的任何偏差，應(yīng)及時進行偏差調(diào)查，按照化驗室偏差管理規(guī)程進行處理并如實記錄，給出合理的偏差處理措施，并上報驗證領(lǐng)導(dǎo)小組，記錄備案，并

18、且根據(jù)處理措施進行相應(yīng)的處理，并對處理的過程、結(jié)果進行記錄與跟蹤。驗證小組根據(jù)數(shù)據(jù)分析，做出相應(yīng)的評定與結(jié)論，報請驗證委員會批準(zhǔn)。8驗證數(shù)據(jù)及評估驗證小組對驗證檢測數(shù)據(jù)進行評估，并對結(jié)果進行評價結(jié)果評價： 評價人： 日期： 9.驗證報告及評審9.1 驗證小組依據(jù)本方案實施驗證，編寫驗證報告。9.2 驗證小組組織專業(yè)人員對驗證報告進行評審。9.3 QA對驗證報告給出結(jié)論，驗證合格發(fā)放驗證合格證。10.再驗證及周期10.1當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進行鱟試劑靈敏度的復(fù)合試驗。10.2 當(dāng)鱟試劑、注射用水生產(chǎn)工藝改變或試驗回家發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變

19、化時，需重新進行干擾試驗。11.驗證文件歸檔驗證結(jié)束，全部驗證文件（驗證方案、驗證報告、驗證記錄、驗證合格證等）歸檔質(zhì)量部。12.附件12.1 驗證小組組成及職責(zé)12.2 驗證前確認(rèn)記錄13.5 驗證結(jié)果評估記錄13.6 驗證合格證驗證前確認(rèn)記錄 一、驗證前儀器儀表確認(rèn) 序號名稱編號上次校驗時間是否在有效期內(nèi)12345 確認(rèn)人： 日期： 附：表1鱟試劑靈敏度復(fù)核記錄檢驗?zāi)康臋z驗日期檢驗依據(jù)室溫試劑名稱生產(chǎn)單位批號靈敏度/效價規(guī)格鱟試劑EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品EU/支細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水實驗操作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：儀器名稱保溫時間（ ）保溫溫度結(jié)果記錄: 濃度平行樣2l1l0.5l0.25l陰性對照12

20、3/4/結(jié)算lc過程：平行樣鱟試劑標(biāo)示靈敏度l系列遞減呈陽性的最低稀釋倍數(shù)反應(yīng)終點濃度（系列遞減的最后一個陽性濃度）反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值1234鱟試劑靈敏度標(biāo)示值l=0.25測試值c = lg-1 (X/4)XX/4c = lg-1 (X/4)鱟試劑靈敏度標(biāo)示值l允許范圍0.5l2l靈敏度l是否符合要求檢驗員復(fù)核人表2干擾試驗記錄檢品名稱檢驗日期生產(chǎn)單位室溫供樣單位規(guī)格批號包裝檢驗依據(jù)內(nèi)毒素限度試劑名稱生產(chǎn)單位批號靈敏度/效價規(guī)格鱟試劑EU/ml細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品EU/支細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水實驗操作1.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：2. 供試品制備：3. 含供試品內(nèi)毒素溶液的制備：儀器名稱保溫時間（ ）保溫溫度結(jié)果記錄: 鱟試劑28支平行管內(nèi)毒素濃度2l1l0.5l0.25l陰性對照A：供試品溶液A1/A2/B：2l/供試品溶液B1/B2/B3/B4/C：2l/檢查用水C1/C2/D：檢查用水D1/D2/系列溶液C鱟試劑靈敏度對照系列：計算ES平行樣鱟試劑標(biāo)示靈敏度l系列遞減呈陽性的最低稀釋倍數(shù)反應(yīng)終點濃度（系列遞減的最后一個陽性濃度）反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值1234鱟試劑