擬穴青蟹甲殼肽(Crustin)的免疫功能研究

1、擬穴青蟹甲殼肽（Crustin ）的免疫功能研究擬穴青蟹 (Scylla paramamosain),簡稱青蟹 , 是我國重要的經(jīng)濟蟹類之一,廣泛分布于我國的東海和南海等海域。近年來, 伴隨著蟹類養(yǎng)殖規(guī)模的擴大以及其集約化養(yǎng)殖的發(fā)展 , 各種養(yǎng)殖病害頻發(fā)嚴重制約了蟹類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。青蟹憑借其獨特的先天性免疫系統(tǒng), 在外界不良生存環(huán)境中有效地抵御外界病原菌的入侵 , 因而其先天免疫防御機制的研究備受關(guān)注。甲殼肽 (Crustin)是甲殼動物免疫系統(tǒng)的重要效應分子, 本研究我們從青蟹中鑒定了3 個甲殼肽基因 ,分別命名為 SpCrus3、SpCrus4 和 SpCrus5。當前文獻報道將甲殼肽分

2、為5 類, 在 I 型甲殼肽中 , 信號肽序列和 WAP結(jié)構(gòu)域之間含一個半胱氨酸富含區(qū)。通過對獲得的SpCrus3 和 SpCrus4 序列進行分析 ,我們發(fā)現(xiàn)這兩個分子均屬于I 型甲殼肽 , 并且這兩個基因的cDNA序列含有相同的5端。表達模式分析顯示 :SpCrus3 和 SpCrus4主要在鰓中表達 ; 在副溶血弧菌或金黃色葡萄球菌刺激后 ,SpCrus4 上調(diào)表達 , 而 SpCrus3 下調(diào)表達。 雖然 SpCrus3 和SpCrus4 具有 66.06%的相似性 , 但 SpCrus4 的抗菌活性強于 SpCrus3。微生物結(jié)合實驗表明SpCrus3和 SpCrus4對所有受試微生

3、物均具有結(jié)合活性。多糖結(jié)合實驗表明這兩個蛋白對細菌多糖如脂多糖(LPS) 、脂磷壁酸 (LTA) 和肽聚糖 (PGN)都具有結(jié)合活性 , 并且 SpCrus3和 SpCrus4 對 LPS和 LTA的結(jié)合活性強于PGN。此外 ,SpCrus4 對 LTA的結(jié)合活性強于SpCrus3, 這可能是這兩個蛋白之間抗菌活性呈現(xiàn)顯著差異的原因。凝集實驗表明SpCrus4 對微生物的凝集活性強于SpCrus3, 這種增強的凝集活性可能有助于SpCrus4 表現(xiàn)出更強的抗菌活性。基于以上結(jié)果 , 我們提出了 SpCrus3 和 SpCrus4 參與青蟹抗菌免疫的模型 :SpCrus3 在健康的青蟹中高度表達

4、以保持低水平的抗菌活性 ; 當細菌感染青蟹時 , 誘導產(chǎn)生大量的 SpCrus4 表現(xiàn)出對細菌更強的抗菌活性。根據(jù)當前分類標準 ,II 型甲殼肽在 N端鄰近信號肽區(qū)有一段較長的富含甘氨酸的疏水區(qū)域 (GRR)和一個半胱氨酸富含區(qū) , 同時在 C 端含有一個 WAP結(jié)構(gòu)域。GRR結(jié)構(gòu)域是區(qū)分 I 型和 II型甲殼肽的主要標記基序, 并且一些研究表明含有 GRR的 II型甲殼肽比 I 型甲殼肽具有更廣泛的抗菌譜。我們發(fā)現(xiàn)SpCrus5 序列的 C 端含有一個 GRR結(jié)構(gòu)域 , 這與經(jīng)典的 II型甲殼肽的含有 N 端 GRRs結(jié)構(gòu)域不同。表達模式分析顯示 :SpCrus5 主要在鰓中表達 ; 在副溶

5、血弧菌或金黃色葡萄球菌刺激后 ,SpCrus5 上調(diào)表達 , 表明 SpCrus5 可能參與抗菌免疫反應。 為了進一步闡明這種 C 端 GRR結(jié)構(gòu)域是否影響SpCrus5 的功能 , 我們通過刪除 GRR結(jié)構(gòu)域獲得了 GRR缺失突變體 (SpCrus5-GRR)。SpCrus5 成熟蛋白的抗菌活性強于SpCrus5-GRR,前者對革蘭氏陰性菌的抗菌譜也廣于后者 ;SpCrus5 蛋白對微生物細胞的結(jié)合活性和多糖結(jié)合活性強于SpCrus5-GRR;SpCrus5和 SpCrus5-GRR凝集所有受試的革蘭氏陽性菌。上述實驗表明 ,SpCrus5 對微生物多糖的結(jié)合活性以及對微生物的凝集活性有助于發(fā)揮其抗菌活性 , 并且其 C 端 GRR結(jié)構(gòu)域能夠增強 SpCrus5 的抗菌活性并拓寬其抗菌譜。雖然根據(jù)經(jīng)典分類方法 ,SpCrus5 屬于 I 型甲殼肽 , 但 SpCrus5 與大多數(shù) II型甲殼肽具有高度相似性并且其功能與一些II 型甲殼肽相似 , 表明 SpCrus5更像一個非經(jīng)典的 II型甲殼肽。綜上所述 , 本研究對青蟹中3 個甲殼肽基因進行了表達模式及免疫功能研究 , 發(fā)現(xiàn) SpCrus3、SpCrus4 和