擬穴青蟹陽離子非依賴6-磷酸甘露糖受體(SpCI-MPR)基因的克隆和功能研究

1、擬穴青蟹陽離子非依賴6- 磷酸甘露糖受體（SpCI-MPR）基因的克隆和功能研究陽離子非依賴 6- 磷酸甘露糖受體 (cation-independentmannose-6-phosphate receptor,CI-MPR)又稱胰島素樣生長因子II受體(Insulin-like growth factor-II receptor,IGF2R),隸屬于 P 型凝結素家族 ,是一種多能細胞受體。然而, 過去對 CI-MPR的研究主要局限于脊椎動物, 在甲殼動物中尚沒有相關的研究報道。擬穴青蟹 (Scylla paramamosain)是一種典型的甲殼動物 , 廣泛分布于我國的東南沿海等地。近年來

2、, 對擬穴青蟹的研究已取得了一定成果。擬穴青蟹良好的研究背景為研究CI-MPR基因的功能奠定了基礎。本研究以擬穴青蟹 CI-MPR(以下稱 Sp CI-MPR)基因為研究對象 , 主要研究內容和結果如下 :1. 獲得擬穴青蟹 CI-MPR基因的全長序列本研究在已知部分序列的基礎上 , 利用 RACE方法獲得了擬穴青蟹 Sp CI-MPR基因的 c DNA 全長序列 , 序列已上傳至Gen Bank(Accession number:KM658157) 。該序列長度為 3931 bp, 編碼 1095 個氨基酸。序列分析顯示該基因編碼的蛋白含有 7 個保守的“ MRH”結構域 , 每個結構域均含

3、有保守的6-8 個半胱氨酸 , 該結構為 CI-MPR蛋白的特異保守結構域。對氨基酸序列進行BLASTP在進行同源性檢索發(fā)現Sp CI-MPR 蛋白序列與其它動物的 CI-MPR蛋白序列具有較高的同源性。 基于 CI-MPR蛋白氨基酸序列構建的系統進化樹同物種進化關系保持一致。由此表明已成功克隆到擬穴青蟹Sp CI-MPR基因的 c DNA全長序列。 2. 生物信息學方法對 Sp CI-MPR基因進行功能和特征分析該蛋白存在大量的糖基化和磷酸化位點。在 Sp CI-MPR蛋白的 7 個結構域中 , 結構域 5 和結構域 6 同哺乳動物的結構域 3 和結構域 9 擁有較高的同源性 , 推測兩個結

4、構域在磷酸甘露糖 (mannose6-phosphate,Man-6-P) 結合時發(fā)揮著重要的作用。同時, 基于結構比對的分析發(fā)現 ,Sp CI-MPR 蛋白缺少與 IGF-II結構位點相關的疏水基團和必須氨基酸, 由此推測擬穴青蟹的Sp CI-MPR蛋白不具有調控IGF-II的功能。3. 對 Sp CI-MPR基因進行時空表達分析為研究 Sp CI-MPR基因對擬穴青蟹生長和早期發(fā)育的影響 , 本文檢測了其在擬穴青蟹從剛出生后的蚤狀幼體 I 期(Zoea I,Z1)、蚤狀幼體 II期(Zoea II,Z2)、蚤狀幼體 III期 (Zoea III,Z3)、蚤狀幼體 IV 期(Zoea IV,

5、Z4)、蚤狀幼體 V 期(Zoea V,Z5) 和大眼幼體(Megalopae,M)Sp CI-MPR 基因表達量的變化。結果發(fā)現, 從胚胎到幼體出生后3天內其表達量無顯著變化, 此后其表達量逐漸上升, 在 Z2 達到最高 , 然后逐漸下降并趨于平穩(wěn)。同時 , 我們還檢測了該基因在擬穴青蟹肌肉、血液、肝胰腺、胃、腮、睪丸、卵巢、心臟鰓、結締組織、胸神經節(jié)和腦神經節(jié)這11 個組織中的表達分布情況。結果顯示 Sp CI-MPR基因的表達量呈現一定的組織特異性, 在肝胰腺、血液和心臟這 3 個組織中的表達量最高 , 在其他組織中的表達量較低。上述結果暗示 Sp CI-MPR基因可能在擬穴青蟹的生長發(fā)

6、育起著重要的作用。4. 擬穴青蟹中 Sp CI-MPR 基因的印跡表達模式以及與其表達量之間的關系對SpCI-MPR基因的序列分析發(fā)現在5端含有大量的 Cp G島序列 , 為潛在的甲基化位點 , 提示該基因可能為印跡基因。對雜合子等位基因的轉錄情況分析表明Sp CI-MPR基因為印跡基因。 組織水平的分析提示 Sp CI-MPR 基因在擬穴青蟹中印跡表達模式具有組織特異性。同時結果顯示 Sp CI-MPR基因在正常非印跡組織中的表達量明顯高于印跡組織中的表達量 ,Sp CI-MPR基因的印跡狀態(tài)與其表達水平之間具有一定的相關性。印跡調控通過改變有效轉錄基因的拷貝數來進行調控表達對基因的表達量進行調控 , 從而影響生長和發(fā)育等過程。5. 載體構建了原核表達載體 , 獲得重組蛋白此外 , 我們利用 p ET-30a(+) 載體構建了原核表達載體 , 并在大腸桿菌 (Escherichia coli)BL21(DE3)菌株中表達得到了 130.5 k Da的融合蛋白 , 同時我