改性聚乙烯亞胺及其葉酸修飾的反義寡核苷酸傳遞系統(tǒng)的研究

1、改性聚乙烯亞胺及其葉酸修飾的反義寡核苷酸傳遞系統(tǒng)的研究在腫瘤治療領域中 , 反義寡核苷酸 (Antisense oligonucleotide,AS-ODN)類藥物及相關治療技術越來越得到大家的重視。目前雖然已有AS-ODN類藥物進入臨床階段 , 但仍存在穩(wěn)定性差、跨膜能力弱、易被核酸酶降解等問題。LOR-2501是一種含有 20 個堿基的 AS-ODN,因為能夠與核糖核苷酸還原酶(Ribonucleotidereductase,RNR) 大亞基 R1 的 m RNA編碼區(qū)互補 , 具有一定的抗腫瘤活性。目前大量的研究集中于AS-ODN類藥物載體的開發(fā)和應用領域。聚乙烯亞胺 (Polyethy

2、leneimine,PEI)與其他陽離子聚合物相比, 有著獨特的“質子海綿效應” ,PEI 裝載藥物后能夠通過大量的氨基吸收質子, 導致溶酶體滲透性腫脹 , 破裂后將藥物釋放到細胞質中。PEI 作為 AS-ODN載體時 , 高分子量的 PEI(25k Da)轉染效率相對較高但是毒性較大 , 而低分子量的 PEI(800 Da)毒性較小但轉染效率也相對較低 , 因此如何通過 PEI 的改性和靶向配體修飾等研究方法在提高 PEI 轉染效率的同時減少其毒性成為了研究熱點。本論文研究內容主要包括以下幾部分 :1.PEI-SS-OA 的合成及載藥系統(tǒng)的建立本文首先在 PEI 的基礎上 , 合成了一種含有

3、二硫鍵 (S-S) 的聚合物 , 使用油胺(Oleylamine,OA) 對其進行了疏水性修飾 ( 命名為 PEI-SS-OA)。同時采用乙醇注入法制備了 PEI-SS-OA載藥系統(tǒng)。制備的 PEI-SS-OA載藥系統(tǒng)具有一定的緩沖容量, 進入細胞后能夠有效地釋放自身攜帶的藥物。在最優(yōu)制備條件下的粒徑為201.0 5.9 nm,zeta電位值為43.5 0.9 m V 。PEI-SS-OA對 He La 和 A549 細胞無明顯毒性 , 細胞活力均在 90%以上。在 30天內 ,PEI-SS-OA 載藥系統(tǒng)的粒徑略有增加,zeta電位值無明顯變化。2.PEI-SS-OA/LOR-2501 傳遞

4、系統(tǒng)的建立和評價為了對制備的PEI-SS-OA載體的轉染效率進行評價 , 本文選擇了一種AS-ODN類藥物 LOR-2501,建立了PEI-SS-OA/LOR-2501傳遞系統(tǒng)。首先以粒徑和zeta 電位為指標 , 得到了最佳的氮磷比 (N/P) 為 8:1 。此時 ,PEI-SS-OA 與 LOR-2501已完全結合 , 還原劑的加入能夠促使LOR-2501的釋放。體外細胞評價實驗中,MTT抗腫瘤實驗和流式細胞計數(shù)法測定轉染效率實驗結果表明制備的PEI-SS-OA 載體能夠將 LOR-2501轉染進入到 He La 和 A549細胞中 , 抑制腫瘤細胞的生長。采用激光共聚焦顯微鏡觀察到PEI

5、-SS-OA/LOR-2501復合物能夠大量地進入到腫瘤細胞。實時熒光定量PCR測定 R1 m RNA結果顯示 , 復合物在 He La 和 A549細胞中對 R1 mRNA的下調效率分別為 40.8%和 43.6%, 與 PEI 相比分別提高了 17.8%和 23.3%。Western-blot測定 R1蛋白結果顯示 ,PEI-SS-OA 組的 R1 蛋白下調效率明顯高于 PEI 組。 3.PEI-NH-OA 的合成及載藥系統(tǒng)的建立本文同時在PEI 的基礎上 ,合成了一種含有酰胺鍵 (N-H) 的聚合物 , 使用油酰 (Oleoacyl,OA) 對其進行了疏水性修飾 ( 命名為 PEI-NH

6、-OA)。采用乙醇注入法制備了PEI-NH-OA載藥系統(tǒng)。 PEI-NH-OA同樣具有一定的緩沖容量。在最優(yōu)制備條件下的粒徑為102.0 3.9 nm,zeta 電位值為 54.5 3.1 m V。PEI-NH-OA與 PEI 本身相比毒性明顯減小 ,He La 和 A549細胞活力均在 90%以上。在 30 天內 ,PEI-NH-OA 載藥系統(tǒng)粒徑和zeta 電位均無明顯變化。與PEI-SS-OA載藥系統(tǒng)相比 ,PEI-NH-OA 載藥系統(tǒng)粒徑更小 , 陽離子特性更強 , 具有更好的穩(wěn)定性。4.PEI-NH-OA/LOR-2501傳遞系統(tǒng)的建立和評價本文同時建立了PEI-NH-OA/LOR-

7、2501傳遞系統(tǒng) , 對 PEI-NH-OA的轉染效率進行了評價。 以粒徑和zeta 電位為指標 , 得到了最佳的N/P 為 6:1 。此時 ,PEI-NH-OA 與 LOR-2501已完全結合 , 形成納米復合物。抗腫瘤實驗顯示復合物對 He La 和 A549 細胞的抑制率分別為46.2%和 41.5%。通過流式細胞計數(shù)和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 復合物能夠大量地進入到He La 和 A549 腫瘤細胞內。實時熒光定量 PCR測定 R1 mRNA結果顯示 ,PEI-NH-OA作為載體時 , 在 He La 和 A549細胞中對 R1 mRNA的下調效率分別為37.7%和 34.5%,而

8、PEI 組僅為 20%左右。Western-blot測定 R1蛋白結果顯示 ,R1 蛋白的下調率分別為50.1%和 46.3%?？梢?PEI-NH-OA能夠高效地將 LOR-2501轉染進入細胞 , 與 PEI-SS-OA相比穩(wěn)定性較高且粒徑較小 , 后期實驗中選擇對其進行進一步修飾。5.FA/PEI-NH-OA/LOR-2501 傳遞系統(tǒng)的建立和評價本文在PEI-NH-OA/LOR-2501復合物基礎上 , 進一步將葉酸 (Folic acid,FA)與上述復合物通過靜電吸附作用結合, 得到 FA/PEI-NH-OA/LOR-2501傳遞系統(tǒng)。FA/PEI-NH-OA/LOR-2501復合物

9、在最佳比例時粒徑為159.0 1.1 nm,zeta電位值為 -12.2 1.3 m V, 加入 FA后的 PEI-NH-OA載體仍能夠與 LOR-2501緊密結合。FA/PEI-NH-OA載體無明顯毒性 , 細胞活力均在 80%以上。體外細胞抗腫瘤評價實驗中 , 對 He La 和 A549 細胞的抑制率分別達到55.6%和 53.7%。流式細胞計數(shù)檢測轉染效率結果顯示, 復合物在葉酸受體高表達(FR+)的 HeLa 細胞中和葉酸受體低表達(FR-) 的 A549細胞中 , 平均熒光強度是 FA修飾前的 2倍以上 , 在 KB細胞 (FR+)和 SK-HEP-1細胞 (FR-) 中同樣出現(xiàn)此

10、現(xiàn)象。激光共聚焦顯微鏡觀察結果顯示復合物能夠大量地進入到腫瘤細胞中。R1 m RNA測定結果顯示 , 在 He La 和 A549 細胞中 ,R1 m RNA下調效率分別為51.7%和 45.7%。Western-blot測定 R1蛋白結果顯示 ,R1 蛋白下調效率分別達到72.0%和 68.9%, 與未修飾的載體相比大幅提高。6.FA/PEI-NH-OA/LOR-2501 傳遞系統(tǒng)內化機制的初步研究首先考察了游離FA對 FA/PEI-NH-OA/LOR-2501納米復合物進入腫瘤細胞過程的影響。結果顯示 ,加入濃度為 0.01 、0.1 、1 mmol/L 的游離 FA 組與未加入游離 FA 組相比 , 無論在He La、 KB細胞 (FR+)還是 A549、SK-HEP-1細胞 (FR-) 中, 并沒有對復合物的攝取情況有一定的影響。同時考察了三種內吞途徑抑制劑蔗糖、細胞松弛素 D 和制霉菌素對復合物內吞過程的影響。結果顯示, 復合物可能主要是通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞途徑進入到細胞中的。使用三種內化途徑特異性染料標記細胞后, 采用激光共聚焦顯微鏡觀察復合物的攝取情況 , 結