抗菌藥物敏感試驗課件【業(yè)界精制】

1、抗菌藥物敏感性概述 抗菌藥物敏感性試驗方法 全國“細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)”簡介,1,優(yōu)選知識,敏感和耐藥的概念,從本質(zhì)上講：細菌對某種抗菌藥物是敏感還是耐藥，常以該抗菌藥物的治療濃度與MIC的關(guān)系而定,常用劑量的抗菌藥物通過常用途徑所能達到的血藥濃度,2,優(yōu)選知識,血藥濃度與MIC之間的關(guān)系,敏感,中介耐藥,耐藥,上限,下限,3,優(yōu)選知識,抗菌藥物的治療濃度與MIC的關(guān)系： 若MIC小于治療濃度， 則為“敏感”（Sensitive , S ），推薦使用。 若MIC大于治療濃度， 則為“耐藥”（ Resistant , R ）； 若MIC介于治療濃度的上下限之間， 則為“中度耐藥”（ Intermedi

2、ate , I ）或中度敏感,敏感和耐藥的概念,4,優(yōu)選知識,5,優(yōu)選知識,敏感,治療濃度的上限即表中的 R,治療濃度的下限即表中的 S,耐藥,中介耐藥,治療濃度,CLSI標準,MIC,6,優(yōu)選知識,第一節(jié)、抗菌藥物敏感性試驗方法,需氧和兼性厭氧菌,7,優(yōu)選知識,稀釋法 肉湯稀釋法（試管稀釋法） 瓊脂稀釋法（平板稀釋法） 紙片擴散法（紙片法） E-試驗 聯(lián)合藥物敏感試驗,需氧和兼性厭氧菌藥敏試驗的方法,8,優(yōu)選知識,稀釋法的特點,定量的藥敏試驗，測定MIC、MBC。 方法比較繁瑣，手工操作一般不作為常規(guī)試驗，常用于調(diào)查罕見耐藥。 自動微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)采用微量稀釋法檢測MIC,9,優(yōu)選知識

3、,二、紙片擴散法（disc diffusion test) （Kirby-Bauer法,原理： 將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有測試菌的瓊脂平板上?？咕幬锵颦傊闹軘U散形成遞減的梯度濃度。 藥物敏感細菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的生長受到抑制，形成抑菌圈。 抑菌圈的大小反映測試菌 對藥物的敏感程度。 二者呈正相關(guān),10,優(yōu)選知識,抑菌圈邊緣的藥物濃度 與 MIC,11,優(yōu)選知識,抑菌圈的大小與MIC： 二者呈負相關(guān)，即抑菌圈愈大，MIC愈小,12,優(yōu)選知識,紙片法藥敏試驗抑菌圈直徑與結(jié)果解釋的標準,13,優(yōu)選知識,操作方法 ： 1. 制備M-H瓊脂平板，厚度4mm。 2 .制備0.5麥氏比濁管濁度的菌

4、液 （培養(yǎng)1624h，45個菌落）。 3. 菌液均勻涂布于平板。（15分鐘接種完畢） 4. 無菌貼標準抗生素紙片于M-H瓊脂表面， 5. 經(jīng)過351624h孵育。 6. 量取抑菌環(huán)直徑， 根據(jù)CLSI標準， 報告細菌對該抗生素敏感、 耐藥、中介,14,優(yōu)選知識,操作方法 ： 1. 將在約56恒溫的無菌M-H瓊脂傾注直徑為90mm 的平板，其厚度 4mm,15,優(yōu)選知識,2.無菌挑取孵育1624h的血平板上45個菌落,16,優(yōu)選知識,3. 將菌置于無菌生理鹽水中，校正其濁度于0.5麥氏比濁管濁度的菌液,1.5108CFU /ml,17,優(yōu)選知識,4.用無菌棉簽浸入細菌懸液中，將拭子在試管上壁輕輕

5、擠壓以擠去過多的菌液。棉簽在三個方向均勻抹瓊脂表面（每次轉(zhuǎn)60）使菌液均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周,18,優(yōu)選知識,5.蓋上平板的蓋子，放置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，放置310分鐘后貼上標準抗生素紙片,19,優(yōu)選知識,6.用無菌鑷子或紙片分配器將抗菌紙片粘貼于M-H瓊脂的表面，一旦紙片貼上，不能移動；各抗菌紙片中 心距離應(yīng)大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm,20,優(yōu)選知識,7.經(jīng)過351624h孵育,8.取抑菌環(huán)直徑， 根據(jù)CLSI標準，報告細菌對該抗生素敏感、耐藥、中介,21,優(yōu)選知識,紙片擴散法質(zhì)量控制,培養(yǎng)基：M-H平板厚度，4 mm 細菌懸液：0.5麥氏標準的細菌濃度 藥敏紙片的質(zhì)量

6、各抗菌紙片中心距離應(yīng)大于24mm， 紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15mm。 9cm的平板貼6個 培養(yǎng)時間 質(zhì)控菌株,抑菌圈直徑,22,優(yōu)選知識,23,優(yōu)選知識,根據(jù)抑菌圈的直徑，依照CLSI標準，作出敏感、耐藥、和中介的判斷。為 定性”結(jié)果。 CLSI推薦的最簡單的藥敏試驗,紙片擴散法的特點,24,優(yōu)選知識,三、E試驗法（濃度梯度法,原理： E試條是一條5mm50mm無孔試劑載體，一面固定有一系列預(yù)先制備的濃度呈連續(xù)指數(shù)增長的抗菌藥物，另一面有判別的刻度?？咕幬锏奶荻瓤筛采w有15-20個對倍稀釋濃度的寬度范圍。 將E試條放在細菌接種過的瓊脂平板上，經(jīng)孵育，圍繞試條明顯可見橢圓形抑菌圈，圈的邊緣與試條

7、交點的刻度濃度即為抗菌藥物抑制細菌的MIC。 依照CLSI標準判斷其敏感、耐藥、中介,256 128 8 016,25,優(yōu)選知識,無菌生長區(qū),有菌生長區(qū),26,優(yōu)選知識,橢圓形細菌生長抑制區(qū),256 128 8 016,判讀抑菌濃度 （MIC ug/ml,27,優(yōu)選知識,28,優(yōu)選知識,29,優(yōu)選知識,E test 法特點,優(yōu)點 連續(xù)濃度梯度，與瓊脂稀釋法相關(guān)性好（相關(guān)系數(shù)為0.9）.可測MIC。 操作簡單，影響因素少，穩(wěn)定性高。 缺點：E試條較昂貴; 不適用于生長緩慢的苛養(yǎng)菌,30,優(yōu)選知識,用于病原菌尚未確定的急、重癥感染的經(jīng)驗治療,以擴大病原治療的覆蓋面 治療多種細菌所引起的混合感染 對

8、于某些耐藥菌可取得協(xié)同抗菌作用 減少或推遲治療過程中細菌耐藥性的產(chǎn)生 避免藥物達到毒性劑量,四、聯(lián)合藥物敏感試驗,聯(lián)合藥物意義,31,優(yōu)選知識,增強作用：兩種抗生素聯(lián)用的效果大于它們單獨使用時的效果之和； 2025 相加作用：它們聯(lián)用時的效果等于單用兩種抗生素效果之和； 6070 無關(guān)作用：兩種抗生素聯(lián)用的效果，僅相當于其中一種具有較強作用的抗生素的效果； 拮抗作用：兩種抗生素聯(lián)用時的效果反而小于它們分別使用時的效果之和。 1015,兩種藥物的聯(lián)合使用的效果,32,優(yōu)選知識,兩種抗菌藥物作用部位不同： 內(nèi)酰胺類抗生素（抑制細菌細胞壁合成）與氨基糖苷類抗生素（干擾細菌的代謝）。 增強作用：增加了

9、藥物進入細菌細胞 桿菌肽（降低細胞通透性）與氨基糖苷類藥物（干擾細菌的代謝）。 拮抗作用：降低了藥物進入細菌細胞,抗菌藥物協(xié)同作用發(fā)生原理,33,優(yōu)選知識,棋盤稀釋法 利用肉湯稀釋法原理，依據(jù)兩種藥物的MIC， 以棋盤設(shè)計兩種藥物不同濃度的組合。 計算抑菌濃度指數(shù)（fraction inhaibitory concentration,FIC,聯(lián)合藥物敏感試驗方法,34,優(yōu)選知識,棋盤稀釋法,首先分別測定擬聯(lián)合的抗菌藥物對檢測菌的MIC。 藥物最高濃度為MIC的2倍，對倍稀釋。 兩種藥物的稀釋分別在方陣的縱列和橫列進行，這樣在每管（孔）中可得到不同濃度組合的兩種藥物混合液。 接種菌量為5105C

10、UFml，35孵育18h后觀察結(jié)果。 計算部分抑菌濃度（FIC）指數(shù),35,優(yōu)選知識,抑菌濃度指數(shù)（FIC,FIC,A藥聯(lián)合時的MIC,A藥單測的MIC,B藥聯(lián)合時的MIC,B藥單測的MIC,FIC 0.5為協(xié)同作用； 0.51為相加作用； 12為無關(guān)作用； 2 為拮抗作用,36,優(yōu)選知識,A藥： 32 16 8 4,B藥: 16 8 4 2,生長,生長,生長,生長,生長,生長,生長,生長,生長,生長,生 長,37,優(yōu)選知識,藥敏試驗方法的比較,K-B法： WTO推薦使用的最簡單的定性藥敏試驗。 稀釋法：準確測定MIC、 MBC，比較繁瑣， 試管法一般不作為常規(guī)試驗。 微生物自動分析系統(tǒng)采用微

11、量稀釋法原理。 E試驗：可測定MIC,38,優(yōu)選知識,第二節(jié) 結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗 （了解,首次分離的分枝桿菌需做藥敏試驗，有助于合理用藥和監(jiān)測藥物敏感性。 另外經(jīng)過三個月正規(guī)治療，標本分離培養(yǎng)仍為陽性患者，或感染的嚴重疾患（如播散性結(jié)核病和結(jié)核性腦膜炎）。 以及來自高耐藥流行區(qū)的患者，均須做體外藥敏試驗,39,優(yōu)選知識,四種方法,比例法 放射同位素法 絕對濃度法 耐藥率法,直接法：直接采用圖片陽性的體液標本。（須經(jīng)充分消化五雜菌） 間接法：經(jīng)分離純培養(yǎng)后的次代培養(yǎng)菌,40,優(yōu)選知識,無藥,藥2,藥3,藥1,Middlebrook7H10瓊脂 培養(yǎng)3周,間接比例法（WHO推薦,敏感：含藥格無

12、結(jié)核桿菌生長， 或菌落數(shù)1%對照格 耐藥：含藥格菌落數(shù)1%對照格,不含藥的對照格菌落數(shù)應(yīng)為50150,4 格平板,41,優(yōu)選知識,分枝桿菌微量直視 快速藥敏試驗法,4000 倍,42,優(yōu)選知識,培養(yǎng)72h觀察結(jié)果,INH敏感,RFP耐藥,陽性對照,陰性對照,43,優(yōu)選知識,第三節(jié) 厭氧菌體外藥敏試驗 （了解,厭氧菌感染多為內(nèi)源性感染，厭氧菌藥物敏感性穩(wěn)定，一般不做體外藥敏試驗。 下述情況應(yīng)考慮藥敏試驗： 明確厭氧菌引起的嚴重感染； 已確證的厭氧菌感染，經(jīng)驗性選藥治療未能奏效； 需長期用藥的厭氧菌感染,44,優(yōu)選知識,基本原理和方法與需氧菌相同，只是在培養(yǎng)基、操作環(huán)境和培養(yǎng)條件等應(yīng)根據(jù)厭氧菌的特

13、定需要變動。 培養(yǎng)基為布氏血瓊脂再加人補充劑 5g/ml氯化血紅素，5脫纖維羊,1g/ml Vit K。 厭氧孵育條件 質(zhì)控菌株為脆弱類桿菌ATCC25285,厭氧菌體外藥敏試驗,45,優(yōu)選知識,藥敏試驗結(jié)果的臨床價值,影響抗菌藥物臨床療效的因素很多，據(jù)報道藥敏試驗結(jié)果與臨床療效的符合率約為70% ， 因此細菌培養(yǎng)及藥敏試驗報告只能作為臨床用藥的參考，應(yīng)根據(jù)患者用藥后的治療反應(yīng)和臨床病情及時調(diào)整用藥。 醫(yī)學檢驗的靈魂是與臨床溝通,46,優(yōu)選知識,新的藥敏試驗方法探索,流式細胞術(shù)檢測抗生素最低抑菌濃度 分枝桿菌藥物最低抑菌濃度的快速測定方法研究,47,優(yōu)選知識,細菌耐藥性的發(fā)生過程,細菌獲得與耐

14、藥相關(guān)的基因 編碼與耐藥有關(guān)的蛋白 表現(xiàn)出對某種抗生素的耐藥,基因：537 表型：書533頁 敏感性,48,優(yōu)選知識,第35章第三節(jié)細菌耐藥性檢測,49,優(yōu)選知識,生物化學技術(shù)檢測酶的等電點(等電聚焦電泳) 頭孢哨噻吩濾紙片法 碘淀粉測定法 分析酶的底物譜及抑制物譜 紙片法和稀釋法,1、-內(nèi)酰胺酶檢測,臨床意義：產(chǎn)ESBL克雷伯菌和大腸埃希菌對青霉素、頭孢菌素和氨曲南治療無效,一、耐藥表型檢測,50,優(yōu)選知識,G-菌產(chǎn)生的頭孢菌素酶檢測 -頭孢哨噻吩濾紙片法,用接種環(huán)挑取受試菌于頭孢哨噻吩（產(chǎn)色頭孢菌素）濾紙片上(商品化)， 10分鐘內(nèi)由淺黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色即陽性結(jié)果， 表示頭孢菌素的-內(nèi)酰胺環(huán)

15、被酶打開。 臨床意義：產(chǎn)生該酶的細菌對頭孢菌素類抗生素耐藥,51,優(yōu)選知識,G+菌產(chǎn)生的青霉素酶檢測 -碘淀粉測定法,受試菌混于青霉素溶液，振搖30分鐘。加入淀粉液后，再加入碘液，溶液變藍，繼續(xù)振搖。 10分鐘之內(nèi)藍色消失者為產(chǎn)酶株,青霉素酶,青霉素,青霉素噻唑酸,碘,碘淀粉復(fù)合物變?yōu)闊o色,多為金黃色葡萄球菌產(chǎn)生，對青霉素G耐藥,52,優(yōu)選知識,超廣譜-內(nèi)酰胺酶Extended-Spectyum-Lactamase，ESBL ESBLs,能水解青霉素類，頭孢菌素和氨曲南。 不能水解碳青烯酶類，如亞胺培南 多數(shù)可被內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。 如為ESBL陽性，則對青霉

16、素類，頭孢菌素和氨曲南均報告耐藥，不考慮體外藥敏結(jié)果,53,優(yōu)選知識,常見產(chǎn)ESBLs菌株,最常見是腸桿菌科細菌（大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌）； 其次，陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、弗勞地枸櫞酸菌、銅綠假單胞菌、奈瑟菌等,54,優(yōu)選知識,ESBLs的臨床意義,對產(chǎn)ESBLs菌株，目前最有效的抗生素為碳青霉烯類（泰能），其次，頭孢西丁及含酶抑制劑的復(fù)合劑、氨基糖甙類部分有效。 若臨床出現(xiàn)產(chǎn)ESBLs菌株，會在病人和醫(yī)院之間及不同菌株間相互傳播，應(yīng)引起充分的重視,55,優(yōu)選知識,紙片初篩： 培養(yǎng)基：Muller-Hinton瓊脂 藥敏紙片 接種：按標準紙片擴散法 孵育： 35大氣環(huán)境，16-18小時

17、 結(jié)果： 頭孢泊肟（10ug片）抑菌環(huán)22mm 頭孢他啶（10ug片）抑菌環(huán)22mm 氨曲南 （30ug片）抑菌環(huán)27mm 頭孢噻肟（30ug片）抑菌環(huán)27mm 頭孢曲松（30ug片）抑菌環(huán)25mm,超-內(nèi)酰胺酶檢測紙片擴散法,ESBLs的底物,可能產(chǎn)生ESBLs,56,優(yōu)選知識,培養(yǎng)基：Muller-Hinton瓊脂 藥敏紙片濃度： 頭孢噻肟30ug、頭孢噻肟/克拉維酸30ug/10ug 頭孢他啶30ug、頭孢他啶/克拉維酸30ug/10ug 接種：按標準紙片擴散法 孵育：35大氣環(huán)境，16-18小時 結(jié)果：復(fù)合制劑藥物紙片的抑菌圈直徑 比非復(fù)合制劑藥物紙片的直徑 5mm 以上者為產(chǎn)ESBL

18、s菌,ESBLs的底物 ESBLs的抑制劑,1)紙片確證試驗,57,優(yōu)選知識,混合克拉維酸藥物紙片,無克拉維酸藥物紙片的直徑,直徑差5 mm ：ESBL,58,優(yōu)選知識,篩選試驗： 選用頭孢泊肟、頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟或頭孢曲松至少2種以上， 用標準肉湯稀釋法稀釋至1g/ml, 凡被測菌在上述各管中能夠生長(MIC2g/ml)，高度懷疑為ESBLs，應(yīng)進一步作確認試驗來加以確診,2）液體稀釋法,59,優(yōu)選知識,確認試驗： 用標準肉湯稀釋法測定MIC的方法, 頭孢噻肟單獨稀釋(0.2564g/ml)及 頭孢噻肟(稀釋范圍相同)加克拉維酸(每管4g/ml); 頭孢他啶單獨稀釋(0.25128g

19、/ml)及 頭孢他啶加克拉維酸(每管4g/ml), 上述2種藥物必須同時進行試驗, 結(jié)果加克拉維酸和不加克拉維酸的 MIC差值8倍(3個稀釋度)，可確認為ESBLs菌株,2）液體稀釋法,60,優(yōu)選知識,二、細菌耐藥基因檢測,基因檢測方法檢測細菌耐藥性的優(yōu)缺點 抗生素耐藥性的基因檢測方法 基因檢測方法的應(yīng)用,61,優(yōu)選知識,基因檢測細菌耐藥性的優(yōu)點,能早期指導(dǎo)臨床醫(yī)生治療用藥。 分子遺傳學方法可以直接從臨床標本入手，無需菌株的培養(yǎng)，極大地節(jié)省時間 ， 減輕實驗室生物危險性。 有助鑒別那些處于中介水平或常規(guī)藥敏結(jié)果模棱兩可的結(jié)果。分子生物學方法被認為是“ 金標準” 。 在細菌耐藥性的流行病追蹤調(diào)研

20、中，耐藥基因檢測比抗生素敏感方法更準確。 發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因,62,優(yōu)選知識,基因檢測方法檢測抗生素耐藥性的缺點,當樣品中菌量很少時，其敏感性會大大降低。 對每一個測試的抗菌藥物，均需要設(shè)計相應(yīng)的分子檢測方法，一次只能檢測一種耐藥機制。 目前仍有許多耐藥機制是未知的，無法進行分子檢測。 耐藥基因的檢測也會存在假陽性問題。 對許多耐藥基因的檢測方法，目前還缺乏臨床對照研究以評價其準確性、重復(fù)性及臨床應(yīng)用價值,63,優(yōu)選知識,常見的細菌耐藥相關(guān)基因舉例,64,優(yōu)選知識,耐藥基因檢測方法,分子方法檢測耐藥基因的基礎(chǔ)是 PCR。 在 PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的方法： 分子雜交、 DNA序列分析， 基因微振列技術(shù)

21、等,65,優(yōu)選知識,PCR-序列特異性引物擴增耐藥基因,標 本,提取DNA,PCR擴增目的基因DNA,瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果分析,1 2 3 4,1 2 3 4,耐藥基因的的特異性引物,理想的靶序列應(yīng)當是耐藥基因的編碼區(qū)域，而非編碼區(qū)外的基因( 如插入序列或啟動子序列) 。 特異性高，需要設(shè)立陰性對照,66,優(yōu)選知識,基因芯片技術(shù),芯片制備：以玻璃片或硅片為載體，采用原位合成和微矩陣的方法將寡核苷酸片段或cDNA作為探針按順序排列在載體上。 樣品制備：生物樣品往往是復(fù)雜的生物分子混合體，須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的蛋白質(zhì)或DNA、RNA，然后用熒光標記，以提高檢測的靈敏度和使用者的安全性。 雜交反應(yīng)：即熒光標記的樣品與芯片上的探針進行反應(yīng)產(chǎn)生一系列信息的過程。