微生物生化鑒定[沐風(fēng)書苑]

1、常用生化試驗1 糖、醇發(fā)酵試驗1.糖、醇發(fā)酵試驗原理：各種細菌因含有發(fā)酵不同糖、醇的酶，所以分解糖、醇的能力個不相同。有的能分解某些糖、醇類，有的則不能分解。有的分解某些糖、醇類發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的僅產(chǎn)酸，而不產(chǎn)氣。根據(jù)這些特點，可鑒別細菌。培養(yǎng)基：糖發(fā)酵試驗應(yīng)用的培養(yǎng)基種類很多，大致可分為液體，半固體，固體（高層、斜面）等幾類?？筛鶕?jù)試驗的要求和細菌的特性來選擇。2. 乙酰甲基甲醇試驗（V-P試驗）原理：某些細菌如產(chǎn)氣桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，并將丙酮酸脫羧，變?yōu)橐阴＜谆状迹阴＜谆状荚趬A性環(huán)境下，被空氣中的氧氧化成二乙酰，二乙酰與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色的化合物

2、。故在培養(yǎng)基中加入少量含胍基的化合物，如肌酸、肌酐可增加胍基含量。試驗中加入的-萘酚為催化劑，可加速此反應(yīng)，使反應(yīng)顏色增加，提高反應(yīng)的敏感性。大腸埃希菌不能將丙酮酸脫羧，故V-P試驗呈陰性。培養(yǎng)基：磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基3. 甲基紅試驗（MR試驗）原理：許多細菌如大腸埃希菌等，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再次被分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，這樣使培養(yǎng)基的PH降至4.5以下。這時加入甲基紅指示劑呈紅色。若細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量少，或產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)（如醇、酮、醛、氣體和水等），則培養(yǎng)基的酸度仍在PH6.2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色，為陰性反應(yīng)。培養(yǎng)基：磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基

3、MUG葡萄糖醛酸苷酶試驗原理：細菌的葡萄糖醛酸苷酶在堿性條件下，作用于4-甲基傘形酮-D葡萄糖醛酸甘（4-Methylumbelliferyl-D-glucuronide簡稱MUG）的葡萄糖醛酸甘鍵，使其水解，釋放的4-甲基傘形酮在366nm紫外燈下產(chǎn)生藍白色熒光。培養(yǎng)基：MUG培養(yǎng)基4. -半乳糖苷酶試驗原理：腸桿菌科細菌發(fā)酵乳糖，依靠半乳糖苷滲透酶和-半乳糖苷酶兩種不同的酶作用，能水解鄰硝酸酚-D半乳糖苷（O-nitrophenyl-D-galactopyranoside,ONPG），而釋放出黃色的鄰硝酸酚。發(fā)酵乳糖的細菌具有上述兩種酶，可迅速分解乳糖。遲緩發(fā)酵乳糖的細菌只有-半乳糖苷酶，

4、而缺少半乳糖苷滲透酶或是其活性很弱，不能將乳糖很快運送到菌細胞內(nèi)，通常需要延長培養(yǎng)時間數(shù)天，乳糖才被分解。本實驗主要鑒別腸道細菌，乳糖發(fā)酵及乳糖遲緩發(fā)酵菌為陽性反應(yīng)，非乳糖發(fā)酵酶為陰性。本試驗可作為遲緩發(fā)酵乳糖的細菌的快速鑒定方法。5. 葡萄糖氧化-發(fā)酵（O/F）試驗原理：細菌對糖的代謝分為氧化型和發(fā)酵型兩種。在有氧環(huán)境下氧化完全，生成二氧化碳和水。在無氧環(huán)境下，進行不完全的分解（發(fā)酵），生成酸類、醇類和氣體。氧化型的細菌在無氧環(huán)境中，不能分解糖。發(fā)酵型的細菌無論在有氧或是無氧的環(huán)境中均可分解糖。 葡萄糖氧化-發(fā)酵試驗有助于假單胞菌、硝酸鹽陰性桿菌、糞產(chǎn)堿桿菌的鑒別。培養(yǎng)基：氧化發(fā)酵試驗培養(yǎng)基

5、6. 石蕊牛乳試驗原理：牛乳中含有大量的乳糖和酪蛋白，營養(yǎng)豐富，一般細菌均能在其生長，但各種細菌對這些物質(zhì)的分解能力不同，可觀察的反應(yīng)也不同，在培養(yǎng)基中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑，可觀察到不同的反應(yīng)結(jié)果。 產(chǎn)氣莢膜梭菌對牛乳具有強烈的發(fā)酵反應(yīng)，產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、凝固、胨化幾乎同時發(fā)生。所產(chǎn)生的氣體，可將培養(yǎng)基表層的凡士林沖至管口，牛乳可全被胨化變清，這種“暴風(fēng)雨”樣的發(fā)酵現(xiàn)象稱為“洶涌發(fā)酵”，為該菌所特有。乳鏈球菌可使牛乳培養(yǎng)基產(chǎn)酸、凝固，并可使石蕊還原。培養(yǎng)基：石蕊牛乳培養(yǎng)基2 氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗1.靛基質(zhì)試驗原理：某些細菌，如大腸埃希菌、變形桿菌等，能分解培養(yǎng)基蛋白胨中的色氨酸

6、，形成靛基質(zhì)（吲哚）。靛基質(zhì)無色，與試劑對二甲氨基苯甲醛作用后，形成紅色化合物-玫瑰靛基質(zhì)。本試驗常用于腸桿菌科種屬鑒別，大腸埃希菌98%為陽性反應(yīng)，肺炎克雷伯菌、沙門菌為陰性反應(yīng)。培養(yǎng)基：胰蛋白胨水培養(yǎng)基2. 硫化氫產(chǎn)生試驗原理：檢查腸桿菌科娥硫化氫試驗，是利用細菌對于培養(yǎng)基中硫代硫酸鈉或硫酸鈉、亞硫酸鈉的還原作用，生成硫化氫。硫化氫是無色氣體，遇硫酸亞鐵或枸櫞酸鐵銨，產(chǎn)生不溶性黑色沉淀物硫化亞鐵。按此原理設(shè)計的硫化氫試驗，適用于腸桿菌科細菌的鑒定。沙門菌，弗勞地枸櫞酸桿菌，緩慢愛德華菌，萊克勒菌屬和變形桿菌屬為陽性反應(yīng)，其他細菌均為陰性反應(yīng)。在沙門菌屬中，亦有硫化氫陰性的菌型，如甲型副傷寒

7、、仙臺、豬霍亂沙門菌等，傷寒沙門菌中亦有部分菌株為硫化氫陰性。培養(yǎng)基：三糖鐵瓊脂或克氏雙糖鐵瓊脂培養(yǎng)基。3. 尿素酶試驗原理：某些細菌，如變形桿菌具有尿素酶，能分解培養(yǎng)基中的尿素而產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基成堿性，培養(yǎng)基中的酚紅指示劑呈紅色。本試驗常用語鑒別變形桿菌屬。變形桿菌屬能分解尿素呈陽性反應(yīng)，其他腸道細菌的尿素酶試驗多數(shù)為陰性反應(yīng)。培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基4. 明膠液化試驗原理：明膠是一種膠原蛋白，不具有一般蛋白質(zhì)加熱凝固的特性，其水溶液在24攝氏度以下為凝膠狀態(tài)。明膠可被細菌的膠原酶分解為氨基酸，分解后的明膠，凝固力降低，低于20攝氏度不再凝固，呈液化狀態(tài)。 本試驗為細菌鑒定的常規(guī)實驗法。銅綠

8、假單胞菌，熒光假單胞菌，腐敗假單胞菌等為陽性反應(yīng)，腸桿菌科細菌很少液化明膠。培養(yǎng)基：明膠培養(yǎng)基。5.氨基酸脫羧酶試驗原理：細菌分解氨基酸使其脫羧，生成胺和二氧化碳，此為脫羧反應(yīng)，需要細菌所產(chǎn)生的脫羧酶完成反應(yīng)。各種細菌產(chǎn)生的脫羧酶不同，對各種氨基酸底物所產(chǎn)生的胺亦不相同，但均可使培養(yǎng)基變堿，由培養(yǎng)基中的指示劑顯示出來。培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基6.精氨酸雙水解酶試驗原理：細菌分解精氨酸產(chǎn)堿不限于精氨酸脫羧酶。精氨酸可通過精氨酸脫酰胺酶及瓜氨酸酶，經(jīng)兩次水解，先生成瓜氨酸和氨，后形成鳥氨酸、氨及二氧化碳。鳥氨酸又在鳥氨酸脫羧酶的作用下生成腐胺及二氧化碳。氨和腐氨均為堿性，由培養(yǎng)基中的指示劑顯示出

9、來。培養(yǎng)基：含精氨酸的氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基或用Thomley精氨酸培養(yǎng)基，后者常用于假單胞菌屬鑒定。7.苯丙氨酸脫氨酶試驗原理：變形桿菌屬可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基，形成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng)。本試驗主要用于腸桿菌科細菌鑒定，變形桿菌屬均為強陽性反應(yīng)，而腸桿菌科其他細菌則為陰性反應(yīng)。培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基。3 碳源和氨源利用試驗1. 枸櫞酸鹽利用試驗原理：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基是一綜合性培養(yǎng)基，其中枸櫞酸鈉為碳的唯一來源，磷酸二氫銨為氮的唯一來源。有的細菌如產(chǎn)氣腸桿菌等，可以利用枸櫞酸鹽作為碳源，能在此培養(yǎng)基上生長，并且分解枸櫞酸鹽而最后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。

10、這樣培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍指示劑由綠色變?yōu)樗{色，為枸櫞酸鹽利用實驗的陽性反應(yīng)。若細菌不能利用枸櫞酸鹽作為碳源，則在此培養(yǎng)基上不能生長，培養(yǎng)基不變色，為枸櫞酸鹽利用實驗的陰性反應(yīng)。本試驗主要用于腸桿菌科細菌鑒定，大腸埃希菌、志賀菌屬、愛德華均屬和耶爾森菌屬均為陰性，沙門菌屬，克雷伯均屬，枸櫞酸桿菌和魔秀變形桿菌通常為陽性反應(yīng)。此外，銅綠假單胞菌、洋蔥假單胞菌和嗜水氣單胞菌亦為陽性。培養(yǎng)基：西蒙枸櫞酸鹽培養(yǎng)基2. 丙二酸鹽利用實驗原理：當(dāng)細菌利用丙二酸鹽作為唯一碳源時，丙二酸鈉可被分解成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿。沙門菌亞屬及肺炎克雷伯菌為陽性反應(yīng)，枸櫞酸桿菌屬、腸桿菌屬和哈夫尼亞菌屬有不用生物型反應(yīng)，

11、其他各菌屬為陰性反應(yīng)。培養(yǎng)基：丙二酸鈉培養(yǎng)基。3. 其他有機酸鹽利用試驗原理：酒石酸受細菌酶的作用，可分解為乙酸，草酸等比較簡單的有機酸。枸櫞酸經(jīng)細菌酶的作用進入三羧酸循環(huán)被分解為琥珀酸、乳酸、乙酸等。這些有機酸的生成，使培養(yǎng)基的PH值下降，這可由培養(yǎng)基中的指示劑變化顯示出來。同時未分解的酒石酸和枸櫞酸可與加入的醋酸鉛試劑形成鉛鹽沉淀，故可判斷反應(yīng)程度。細菌的酒石酸分解酶對各種酒石酸光學(xué)異構(gòu)體的分解具有特異性，故可用于細菌的鑒別，此外，粘液酸經(jīng)分解后也可形成簡單的有機酸，亦可由PH降低時指示劑顏色變化進行判斷。本試驗用于腸桿菌科細菌鑒別。沙門菌屬大部分菌屬的右旋酒石酸鹽利用試驗為陽性，志賀菌屬

12、為陰性，沙門菌屬對左旋酒石酸鹽有不同反應(yīng)，其他菌屬均為陰性，不分解粘液酸的只有志賀菌屬。培養(yǎng)基：有機酸鹽培養(yǎng)基4 酶類試驗1. 氧化酶試驗原理：某些細菌如奈瑟球菌和銅綠假單胞菌，具有氧化酶，能將鹽酸二甲基對苯二胺四甲基對二胺試劑氧化成紅色的醌類化合物。2. 細胞色素氧化酶試驗原理：某些細菌如銅綠假單胞菌，具有細胞色素氧化酶，在有分子氧存在的情況下，將試劑鹽酸二甲基對苯二胺氧化，并與-萘酚生成吲哚芬藍，而出現(xiàn)藍色。次試驗常與氧化酶同時進行。3. 觸酶試驗（過氧化氫酶試驗）原理：細胞代謝產(chǎn)生的過氧化氫對細菌細胞有毒，而細胞內(nèi)的過氧化氫酶能催化過氧化氫，使其分解為分子態(tài)氧和水，使其解毒。在含有過氧化

13、氫酶的細菌培養(yǎng)物上滴加過氧化氫溶液后，立即產(chǎn)生大量氣泡，為陰性反應(yīng)。絕大多數(shù)細菌的瓊脂培養(yǎng)物均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌屬為陽性，故用于鑒別葡萄球菌、微球菌（陽性）與鏈球菌。乳酸菌及梭菌為陰性。4. 硝酸鹽還原試驗原理：某些細菌如腸道桿菌，能還原培養(yǎng)基中的硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與試劑中的醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，在與試劑中的萘酚結(jié)合成N萘酚偶氮苯磺酸（紅色）。本實驗在細菌鑒定中廣泛使用，腸桿菌科均為陽性反應(yīng)。培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基5. 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗原理：有些細菌可將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解成氮氣，觀察有無產(chǎn)氣現(xiàn)象，即為亞硝酸鹽還原

14、產(chǎn)期試驗。本試驗常用于鑒別銅綠假單胞菌和其他假單胞菌，前者為陽性反應(yīng)。培養(yǎng)基：硝酸鹽胨水培養(yǎng)基6. 血漿凝固酶試驗原理：測定葡萄球菌的致病性，通常以能否產(chǎn)生血漿凝固酶為準，產(chǎn)生者為致病菌株，不產(chǎn)生者為非致病菌株。但也有少量致病菌株不產(chǎn)生血漿凝固酶。葡萄球菌產(chǎn)生的血漿凝固酶有兩種，一種是結(jié)合在細菌的細胞壁上，直接作用與血漿中的纖維蛋白，使細菌凝成塊狀，破片法實驗的陽性結(jié)果是由此酶形成。另一種是由菌體類產(chǎn)生釋放到菌體外，稱為游離血漿凝固酶，它能使血漿中的凝固酶原變?yōu)槟割惍a(chǎn)物，試管法的陽性結(jié)果是由游離的血漿凝固酶形成。7. 耐熱性脫氧核糖核酸酶試驗原理：某些革蘭陽性均為葡萄球菌、鏈球菌、梭菌等能

15、產(chǎn)生細胞外的脫氧核糖核酸酶（DNase），是培養(yǎng)基中的脫氧核糖核酸長鏈水解，成為由幾個單核苷酸組成的寡核苷酸，但僅有金黃色葡萄球菌所長生的DNase能耐受煮沸而不被破壞。除凝固酶試驗外，這種耐熱的脫氧核酸酶可作為金黃色葡萄球菌重要的鑒定試驗。試驗采用甲苯胺藍DNA瓊脂，其中甲苯胺藍O是一種異染性染料，黨羽DNA結(jié)合時呈藍色；擔(dān)當(dāng)DNA被水解成寡核苷酸或單核苷酸時，甲苯胺藍O與其結(jié)合所產(chǎn)生的吸光光譜是粉紅色，借以判斷DNase的存在。培養(yǎng)基：TrisDNA瓊脂8. 磷酸酶試驗原理：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生磷酸酶，因此其在磷酸酚酞瓊脂平板生長發(fā)育后，分解磷酸酚酞，與濃氨水，菌落變?yōu)榧t色。培養(yǎng)基:磷酸酚酞

16、瓊脂培養(yǎng)基9. 卵磷脂酶試驗原理:產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生卵磷脂酶，此酶可分解血清或卵黃中的磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸膽堿，使血清和卵黃發(fā)生渾濁現(xiàn)象，但這種現(xiàn)象可被產(chǎn)氣莢膜梭菌抗毒素所制止，故可用來鑒別產(chǎn)氣莢膜梭菌。培養(yǎng)基：10%卵黃瓊脂10. 卵黃沉淀試驗原理：次試驗測定產(chǎn)氣莢膜梭菌的卵磷脂酶。因卵黃中含有可溶性磷脂蛋白復(fù)合物，經(jīng)產(chǎn)氣莢膜梭菌的卵磷脂酶作用后，分解為磷脂類及蛋白質(zhì)類的沉淀物。5. 其他試驗1.3%氫氧化鉀試驗原理：在堿性溶液中，革蘭陰性細菌的細胞壁會迅速破裂，細胞類的脫氧核糖核酸，被釋放到堿性溶液中，使溶液的粘性增加并形成粘絲；而革蘭陽性細菌的細胞壁在堿性溶液中不會被分解，細菌均勻的分散在堿性溶液中不會產(chǎn)生粘性。2. 氰化鉀試驗原理：氰化鉀是細菌呼吸鏈末端抑制劑。細胞色素、細胞色素氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶均以鐵釙啉作為輔基，氰化鉀能和鐵釙林結(jié)合，使這些酶失去活性，從而抑制細菌生長。當(dāng)培養(yǎng)基中氰化鉀含量為1:13300或1:10000時，腸桿菌科中沙門菌屬、志賀菌屬和大腸埃希菌的生長受到抑制，但其他細菌如普羅菲登桿菌、哈夫尼亞桿菌等多數(shù)則不能抑制。能否在含有氰化鉀的培養(yǎng)基中生長，是鑒別腸桿菌科中各屬常用的特征之一。培養(yǎng)基:氰化鉀培養(yǎng)基3.綠膿菌素試驗原理：銅綠假單胞菌在代謝過程中能產(chǎn)生水溶性藍綠色的色素，這種色素能擴散到培養(yǎng)基中