病原物的分離與培養(yǎng)

1、病原物的分離與培養(yǎng)病原物的分離與培養(yǎng)在植物病害的研究中具有重要意義，分離、培養(yǎng)病原菌的方法是植物病理學(xué)研究工作中最常應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。一方面，在一個(gè)新的病害研究中，通過(guò)分離與培養(yǎng)獲得病原物的純培養(yǎng)，完成柯氏法則，以明確該病病原；研究病原物的生物學(xué)特性和病害循環(huán)（侵染、病程等等）。所謂病原物的分離，即把該病原菌從發(fā)病組織上與其他微生物分開(kāi)；所謂病原物的培養(yǎng)，即將分離的病原菌移到可以讓這種病原菌正常生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)即培養(yǎng)基上，從而獲得其純培養(yǎng)。病原物的分離與培養(yǎng)，需經(jīng)以以幾個(gè)步驟:1.有關(guān)器皿的滅菌和消毒；2.制作培養(yǎng)基；3.病原菌的分離4.病原菌的培養(yǎng)。、滅菌與消毒滅菌與消毒是兩個(gè)不同的概念。滅菌則

2、是指殺死一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體和孢子。消毒一般是指消滅病原菌和有害微生物的營(yíng)養(yǎng)體，在植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場(chǎng)所都要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒和滅菌。消毒與滅菌的方法很多，一般可分為加熱、過(guò)濾、輻射和使用化學(xué)藥品等方法。(一) 熱力滅菌熱力滅菌分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。1干熱滅菌 干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)疑固性與其本身的含水量有關(guān)。在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白質(zhì)凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高(160170)，時(shí)間長(zhǎng)12 h。但干熱滅

3、菌溫度不能超過(guò)180 ，否則包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的儀器是烘箱。干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種?；鹧鏌茰缇m用于接種環(huán)、接種針和金屬用具如鑷子等，無(wú)菌操作時(shí)酌試管口和瓶口也在火焰上作短暫燒灼滅菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后進(jìn)行灼燒滅菌。通常所說(shuō)的干熱滅菌是在烘箱內(nèi)利用高溫干燥空氣(160170)進(jìn)行滅菌。此法適用于玻璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等的滅菌。進(jìn)行干熱滅菌要注意以下問(wèn)題：物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通；滅菌物品不要接觸烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火；在升溫過(guò)程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內(nèi)停止加溫；電烘箱內(nèi)溫度未降到70以前，切勿

4、自行打開(kāi)箱門以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。2 濕熱滅菌(1) 高壓蒸汽滅菌 此法是將物品放在密閉的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，0.1MPa，121保持1530 min進(jìn)行滅菌。時(shí)間的長(zhǎng)短可根據(jù)滅菌物品種類和數(shù)量的不同而有所變化，以達(dá)到徹底滅菌。這種滅菌適用于培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的滅菌。(2) 常壓蒸汽滅菌 在不具備高壓蒸汽滅菌的情況下：常壓蒸汽滅菌是一種常用的滅菌法。對(duì)于不宜用高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等可采用常壓蒸汽滅菌。這種滅菌方法可用阿諾氏流動(dòng)蒸汽滅菌器進(jìn)行，也可用普通蒸籠進(jìn)行滅菌。由于常壓，其溫度不超過(guò)100，僅能使大多數(shù)微生物被殺死，而芽孢

5、細(xì)菌卻不能在短時(shí)間內(nèi)殺死，因此可采用間歇滅菌以殺死芽孢細(xì)菌，達(dá)到徹底滅菌的目的。常壓間歇滅菌是將滅菌培養(yǎng)基放人滅菌器內(nèi)，每天加熱100，30 min，連續(xù)3 d，第一天加熱后，其中的營(yíng)養(yǎng)體被殺死，將培養(yǎng)物取出放室溫下1824 h，使其中的芽孢發(fā)育成營(yíng)養(yǎng)體，第二天再加熱100，30 min，發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)體又被殺死，但可能仍留有芽孢，故再重復(fù)一次，使徹底滅菌。(二) 過(guò)濾除菌許多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加熱消毒滅菌方法，均會(huì)被熱破壞，因此采用過(guò)濾除菌的方法。應(yīng)用最廣泛的過(guò)濾器有：(1) 蔡氏過(guò)濾器 該過(guò)濾器是由石棉制成的圓形濾板和一個(gè)特制的金屬（銀或鋁）漏斗組成，分上、下兩節(jié)。過(guò)濾時(shí)，用螺旋

6、把石棉板緊緊夾在上、下兩節(jié)濾器之間，然后將溶液置于濾器中抽濾。每次過(guò)濾必須用一張新濾板。根據(jù)其孔徑大小，濾板分為3種型號(hào)：K型最大，作一般澄清用；EK濾孔較小，用來(lái)除去一般細(xì)菌；EK-S濾孔最小，可阻止大病毒通過(guò)。使用時(shí)可根據(jù)需要選用。(2) 微孔濾膜過(guò)濾器 這是一種新型濾器，其濾膜是用醋酸纖維酯和硝酸纖維酯的混合物制成的薄膜。微孔濾膜過(guò)濾器是由上下二個(gè)分別具有出口和入口連接裝置的塑料蓋盒組成。出口處可連接針頭，入口處可連接針筒。使用時(shí)將濾膜裝入兩塑料蓋盒之間，旋緊蓋盒，當(dāng)溶液從針筒注入濾器時(shí)，此濾器將各種微生物阻留在微孔濾膜上面，從而達(dá)到除菌的目的。根據(jù)待除菌溶液量的多少，可選用不同大小的濾

7、器。此法除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過(guò)濾除菌。實(shí)驗(yàn)室中用于除菌的微孔濾膜孔徑一般為0.22m，但若要將病毒除掉，則需更小孔徑的微孔濾膜。微孔濾膜過(guò)濾除菌的主要操作步驟為： 組裝、滅菌 將0.22m孔徑的濾膜裝入清洗干凈的塑料濾器中，旋緊。壓平，包裝滅菌后待用(0.1MPa、121.5滅菌：20 min)。連接。將滅菌濾器的入口在無(wú)菌條件下，以無(wú)菌操作方式連接于裝有待濾溶液注射器上，將針頭與出口處連接并插入帶橡皮塞的無(wú)菌試管中。 壓濾 將注射器中的待濾溶液加壓緩緩擠壓過(guò)濾到無(wú)菌試管中。濾畢，將針頭撥出。壓濾時(shí)，用力要適當(dāng)，

8、不可太猛太快，以免細(xì)菌被擠壓通過(guò)濾膜。提示: 整個(gè)過(guò)程應(yīng)在無(wú)菌條件下嚴(yán)格無(wú)菌操作以防污染，過(guò)濾時(shí)應(yīng)避免各連接處出現(xiàn)滲透現(xiàn)象。(三) 輻射滅菌 紫外線滅菌是用紫外線燈進(jìn)行的。波長(zhǎng)為200300 nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260 nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長(zhǎng)一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線殺菌機(jī)理主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成O，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成過(guò)氧化氫(H2O2)。O3和H2O2有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以只適用于無(wú)菌室、接種箱的空氣及物體表面的

9、滅菌。注意事項(xiàng): 紫外線對(duì)眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用，對(duì)皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光，更不能在紫外線燈光下工作。紫外線燈距照射物以不超過(guò)1.2 m為宜。此外，采用60Co-射線滅菌，也已廣泛用于不能進(jìn)行加熱滅菌的紙、塑料薄膜，各種積層材料制作的容器以及醫(yī)用生物敷料皮等的滅菌。射線滅菌的最大優(yōu)點(diǎn)是穿透力強(qiáng)，可在厚包裝完好條件下滅菌。(四) 化學(xué)藥品滅菌化學(xué)藥品消毒滅菌法是應(yīng)用能抑制或殺死微生物的化學(xué)制劑進(jìn)行消毒滅菌的方法。能破壞細(xì)菌代謝機(jī)能并有致死作用的化學(xué)藥劑為殺菌劑，如重金屬離子等；只是阻抑細(xì)菌代謝機(jī)能，使細(xì)菌不能增殖的化學(xué)藥劑為抑菌劑，如磺胺類及大多數(shù)抗生素等?；瘜W(xué)藥品對(duì)微生物的作用

10、是抑菌還是殺菌以及作用效果還與化學(xué)藥品濃度的高低、處理微生物的時(shí)間長(zhǎng)短、微生物的種類以及微生物所處的環(huán)境等有關(guān)。植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用的化學(xué)藥品有2煤酚皂溶液(來(lái)蘇爾)、0.25新潔爾滅、0.1升汞、35酌甲醛溶液、75乙醇溶液等。消毒與滅菌不僅是從事植物病理學(xué)和整個(gè)生命科學(xué)研究必不可少的重要環(huán)節(jié)和實(shí)用技術(shù)，而且在醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、食品、生物制品等各方面均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。根據(jù)不同的使用要求和條件選用合適的消毒滅菌的方法。附: 高壓滅菌1、目的要求學(xué)習(xí)滅菌與消毒的基本原理及應(yīng)用范圍，學(xué)習(xí)高壓蒸汽滅菌的操作方法。2、基本原理高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使

11、滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中排盡后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100的溫度，導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要。因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒魵獾呐蛎泬?，所以，?dāng)水蒸氣中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。滅菌的溫度及維持的時(shí)間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養(yǎng)基用0.06 MPa、112滅菌15 min，但為了保證效果，可將其他成分先行121滅菌20 min，然后以無(wú)菌操作手續(xù)加入

12、滅菌的糖溶液。又如盛于試管內(nèi)的培養(yǎng)基以0.1MPa，121滅菌20 min；即可，而盛于大瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基最好以0.1MPa、122滅菌30 min。實(shí)驗(yàn)中常用的非自控高壓蒸汽滅菌鍋有臥式和手提式兩種。其結(jié)構(gòu)和工作原理相同，本實(shí)驗(yàn)以手提式高壓蒸汽滅菌鍋為例，介紹其使用方法。全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋在設(shè)定好有關(guān)的參數(shù)后，加溫、放氣、滅菌、干燥可一次完成，使用方法可參照廠家說(shuō)明書。3、材料、試劑與儀器材料 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 (PDA)。儀器與用具 培養(yǎng)皿、手提式高壓蒸汽滅菌鍋、可調(diào)式電爐等。4、操作步驟(1) 首先將內(nèi)層鍋取出，向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。提示：切勿忘記加水，同時(shí)加

13、水量不可過(guò)少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。(2) 放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。提示：注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。(3) 加蓋 并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。(4) 用電爐加熱 并同時(shí)打開(kāi)排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，調(diào)節(jié)電爐控溫旋鈕，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用0.1Mpa l21.5，20 min滅菌。提示：滅菌的主要因

14、素是溫度而不是壓力。因此，鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。(5) 滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至“0”后，打開(kāi)排氣閥，旋松螺栓，打開(kāi)蓋子，取出滅菌物品。提示: 壓力一定要降到“0”后，才能打開(kāi)排氣閥開(kāi)蓋取物。否則會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。(6) 將取出的滅菌培養(yǎng)基放入25溫箱培養(yǎng)48 h，經(jīng)檢查若無(wú)雜菌生長(zhǎng)，即可待用。二、培養(yǎng)基的制作1、目的要求了解培養(yǎng)基的配制原理，掌握培養(yǎng)基的制備方法。2、基本原理在植物病理學(xué)研究工作中經(jīng)常要使用各種不同的培養(yǎng)基。

15、培養(yǎng)基是按照生物生長(zhǎng)繁殖所需要的各種營(yíng)養(yǎng)，用人工方法配制而成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。其中含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素以及水分等。微生物在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖還必須在最適pH范圍內(nèi)才能生長(zhǎng)得更好，因此，對(duì)不同種類的微生物應(yīng)將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到一定的pH范圍。般而言，真菌調(diào)節(jié)到微酸，細(xì)菌調(diào)節(jié)到微堿。培養(yǎng)基的種類很多，不同的微生物所需要的培養(yǎng)基不同。依物理性狀可分為液體的、固體的和半固體的三種。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入1.5 %2 %的瓊脂，半固體培養(yǎng)基是加入0.2 %0.5 %的瓊脂。瓊脂(agar) 起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。根據(jù)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源的不同，培養(yǎng)基可分為天然、半合成和合成培養(yǎng)基三類。天然培

16、養(yǎng)基是以自然界原有的有機(jī)物為材料經(jīng)滅菌后制成，如馬鈴薯、胡蘿卜、水果、大麥粒、高粱粒等。半合成培養(yǎng)基中既有一些天然的有機(jī)物質(zhì)，又有一些成分簡(jiǎn)單或明確的化合物。如常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、肉汁胨培養(yǎng)基(NA)等。合成培養(yǎng)基是由一些成分明確的化合物配制而成的，無(wú)任何成分不明確的物質(zhì)，常用于研究微生物的生理生化性狀，如查氏(Czapek)培養(yǎng)基等。根據(jù)培養(yǎng)基用途不同，可分為生長(zhǎng)繁殖培養(yǎng)基、富集培養(yǎng)基、貯存培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基等。在植物病理學(xué)研究中，最常用培養(yǎng)基有馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，主要用于分離培養(yǎng)病原真菌。在培養(yǎng)基配制完之后，必須經(jīng)過(guò)滅菌，以便徹底殺死其中原有的一切微生物。3、

17、材料、試劑與儀器材料 馬鈴薯。試劑 葡萄糖、瓊脂等。儀器與用品 高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙(或酸度計(jì))、試管、鋁鍋、攪拌棒、三角瓶、燒杯、漏斗、量筒、紗布、棉花、天平等。4、操作步驟PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基) 馬鈴薯（去皮）200 g 、葡萄糖20 g、瓊脂1520g、蒸餾水1000 ml ，自然pH。在PDA培養(yǎng)基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，這樣配制的培養(yǎng)基也稱為PSA培養(yǎng)基。(1) 稱量 稱量去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂1520 g。提示：瓊脂加入的量取決于瓊脂的質(zhì)量，質(zhì)量好的15 g就夠了，質(zhì)量差的應(yīng)適當(dāng)增加。另外，在夏天氣溫較高時(shí)，適當(dāng)增加用量。(2) 將馬鈴薯切成

18、小塊，放入鍋中，加水1000 ml，煮沸30 min。用紗布濾去馬鈴薯殘?jiān)?3) 將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂，加熱熔化。提示：在瓊脂熔化的過(guò)程中，需要用玻璃棒不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。(4) 加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入適量的水以補(bǔ)充加熱過(guò)程中損失的水分，定容至1000 ml。提示：通常在制作培養(yǎng)基的鍋內(nèi)用紅藍(lán)鉛筆標(biāo)記出不同體積的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容時(shí)直接將水加至已標(biāo)記的刻度即可。(5) 分裝 根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可將配制的培養(yǎng)基分裝于試管內(nèi)或三角瓶?jī)?nèi)。分裝試管，其量為管高的15，滅菌后制成斜面。分裝三角瓶的容量以不超過(guò)三角瓶容積之一半為

19、宜。(6) 加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脫脂的經(jīng)彈松的棉花，棉塞可過(guò)濾空氣，防止雜菌侵入并可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)，故在植物病理學(xué)研究工作中普遍使用。正確的棉塞是形狀、劃、松緊與管口或瓶口完全適合，過(guò)緊時(shí)妨礙空氣流通，操作不便；過(guò)松則達(dá)不到濾菌的目的，且棉塞過(guò)小往往容易掉進(jìn)試管內(nèi)。正確的棉塞頭較大，約有13在外，23在試管內(nèi)。分裝過(guò)程中注意不要使培養(yǎng)基沾染在管(瓶)口上以免浸濕棉塞，引起污染。(7) 包扎 加塞后，將試管用線繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道線繩扎好。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、組別、制作人等。(8) 滅菌 將上述培養(yǎng)基以0.

20、1MPa，121，高壓蒸氣滅菌20 min。(9) 擱置斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基豎置冷至50左右(以防斜面上冷凝水太多)，將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長(zhǎng)度以不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半為宜。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須放在37溫箱培養(yǎng)24h，無(wú)菌生長(zhǎng)者方可使用。PDA培養(yǎng)基一般不需要調(diào)pH。對(duì)于要調(diào)節(jié)pH的培養(yǎng)基，一般用pH試紙測(cè)定其pH。如果培養(yǎng)基偏酸或偏堿時(shí)，可用l molL NaOH或l molL HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)時(shí)應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過(guò)酸或過(guò)堿破壞培養(yǎng)基成分。5、流程圖培養(yǎng)基配制 高壓滅菌 培養(yǎng) 觀察三、病原菌的分離培養(yǎng)和純化1、目的要求(1) 了解

21、分離與純化微生物的基本原理及方法。(2) 掌握倒平板的方法和組織分離、稀釋分離、平板劃線分離的基本操作技術(shù)。(3) 掌握在平板、斜面及液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)病原菌及觀察其培養(yǎng)性狀的方法。2、基本方法植物病原真菌的分離方法主要有組織分離法和稀釋分離法兩種。最常用的方法是組織分離法，而稀釋分離法主要用于病組織上產(chǎn)生大量孢子的病原真菌的分離。病原細(xì)菌的分離方法以劃線分離法為最常用，在有些情況下也采用稀釋分離法。為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須要進(jìn)行分離菌的純化，純化的方法類似于分離工作中采用的稀釋分離法或劃線分離法。3、材料、儀器與用具3.1 材料 (1) 稻瘟?。ㄈ~、病節(jié)、病穗頸）(Pyricularia

22、oryzae)。(2) 柑桔炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）。(3) 黃瓜灰霉?。˙otrytis cineria）。(4) 番茄灰霉?。ü?Botrytis cinerea)。(5) 黃瓜菌核?。ü?Sclerotinia sclerotiorum)。(6) 黃瓜細(xì)菌性角斑?。ㄈ~）(Pseudomonas syringae pv1achryrnans) 。(7) 水稻白葉枯?。ㄈ~）(Xanthomonas campestris pvoryzae) 。(8) 白菜軟腐?。ㄈ~）(Erwinia carotovora subsppcarotovora)。3

23、.2培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；肉膏蛋白脈培養(yǎng)基；加寄主組織煎汁的培養(yǎng)基等。3.3儀器與用品 超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、吸管、吸水紙、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、鑷子、接種鏟(針)、接種環(huán)(鉺)、70酒精、0.1升汞、酒精燈、火柴、記號(hào)筆、橡皮筋套、可調(diào)式電爐、不銹鋼鍋等。4、實(shí)驗(yàn)操作(一) 病原真菌的分離1組織分離法 其步驟為：(1) 取滅菌培養(yǎng)皿一個(gè)，置于濕紗布上，在皿蓋上用玻璃鉛筆注明分離日期、材料和分離人的姓名。提示：無(wú)菌操作應(yīng)注意下面幾點(diǎn)：工作前將所需的物品都放在超凈工作臺(tái)內(nèi)；操作前用肥皂洗手，操作時(shí)還需用70 酒精擦拭雙手；無(wú)菌操作時(shí)，呼吸要輕，不要說(shuō)話。（2） 用無(wú)菌操作法向培養(yǎng)皿中加

24、入25乳酸12滴(可減少細(xì)菌污染)，然后將融化而冷至60左右的PDA培養(yǎng)基倒人培養(yǎng)皿中，每皿倒1015 ml，輕輕搖動(dòng)使之成平面。凝固后即成平板培養(yǎng)基。提示：加入25乳酸12滴，可減少平板上出現(xiàn)污染細(xì)菌菌落。除乳酸外，在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)目咕匾种萍?xì)菌的生長(zhǎng)，也是常用的方法。加青霉素(20gm1)可以抑制G+ 細(xì)菌生長(zhǎng)；加多黏霉素B(5.0gml。)可以抑制G-細(xì)菌生長(zhǎng)；加鏈霉素(40gml)或氯霉素(50gm1)可以抑制大部分細(xì)菌的生長(zhǎng)。除了氯霉素可在滅菌前加入外，其他抗菌素都應(yīng)在滅菌后并冷卻到45左右(以手背觸三角瓶感到燙，但尚可以忍耐為宜)時(shí)加入。倒平板過(guò)程中只要遵循“穩(wěn)、輕、快”要領(lǐng)，

25、不必在火焰上方，一般很少污染。(3) 取真菌葉斑病的新鮮病葉(或其他分離材料)，選擇典型的單個(gè)病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣(病健交界處，)切取小塊(每邊長(zhǎng)34 mm)病組織數(shù)塊。提示：選擇新患病的組織作為分離的材料，可以減少腐生菌混入的機(jī)會(huì)。腐生菌一般在發(fā)病很久而已經(jīng)枯死或腐敗的部分滋生，因此，一般斑點(diǎn)病害應(yīng)在臨近健組織的部分分離。（4）將病組織放入70酒精中浸35s后，按無(wú)菌操作法將病組織移入0.1升汞液中分別表面消毒05、1、2、3、5 min (也可使用其他表面消毒劑)，如植物組織柔嫩，則表面消毒時(shí)間宜短；反之則可長(zhǎng)些。然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留的消毒劑。提示：先用70的酒

26、精浸23 s是為了消除寄主表面的氣泡，減少表面張力，70的酒精亦用于表面消毒，處理的時(shí)間較短(一般數(shù)秒至l min)升汞溶液消毒的時(shí)間因材料而異，可自30s至30min不等，一般情況下，需時(shí)間35 min。(5) 用無(wú)菌操作法將病組織移至平板培養(yǎng)基上，每皿內(nèi)放46塊。提示：在將病組織小塊移放到平板表面之前，應(yīng)將其在無(wú)菌吸水紙上吸去多余的水，以大大減少病組織附近出現(xiàn)細(xì)菌污染。(6) 將培養(yǎng)皿倒置放入25左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。一般34 d后觀察待分離菌生長(zhǎng)結(jié)果。(7) 若病組織小塊上均長(zhǎng)出較為一致的菌落，則多半為要分離的病原菌。在無(wú)菌條件下，用接種針(鏟)自菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上，在25 左

27、右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后，觀察菌落生長(zhǎng)情況，如無(wú)雜菌生長(zhǎng)即得該分離病菌純菌種，便可置于冰箱中保存。提示：除根據(jù)菌落的一致性初步確定長(zhǎng)出的菌落是否目標(biāo)菌外，還要在顯微鏡下檢查，進(jìn)一步確定。如果是對(duì)未知病原菌的組織分離，則要將長(zhǎng)出的菌落分別轉(zhuǎn)出，通過(guò)進(jìn)一步的接種實(shí)驗(yàn)明確哪一種為其病原菌。在組織分離工作中，如果植物材料體積較大且較軟(如患灰霉病的番茄果實(shí))，在分離過(guò)程中可直接挖取內(nèi)部患病組織移入平板培養(yǎng)基上，完成分離工作。2. 稀釋分離法(1) 取滅菌培養(yǎng)皿三個(gè)，平放在濕紗布上，編號(hào)，并注明日期、分離材料及分離人姓名。(2) 用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一皿中分別注入0.51.0 ml。(3) 用移植環(huán)

28、蘸一滴孢子懸浮液，與第一個(gè)培養(yǎng)皿中的滅菌水混合，再?gòu)牡谝粋€(gè)培養(yǎng)皿移三環(huán)到第二個(gè)培養(yǎng)皿中，混合后再移三環(huán)到第三個(gè)培養(yǎng)皿中。(4) 將熔化并冷卻到4550的培養(yǎng)基，分別倒在三個(gè)培養(yǎng)皿中(為防止細(xì)菌污染，也可以向每個(gè)培養(yǎng)皿中事先加入12滴25乳酸)，搖勻，凝固，要使培養(yǎng)基與稀釋的菌液充分混勻。提示： 倒平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度一定要掌握好，過(guò)熱易將病原菌燙死而使分離失敗，過(guò)冷則倒入培養(yǎng)皿中后難以形成平板，不利于分離。(5) 將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)后置恒溫箱(25)中培養(yǎng)，數(shù)日后觀察菌落生長(zhǎng)情況。(6) 挑菌 將培養(yǎng)后長(zhǎng)出較為整齊一致的單個(gè)菌落分別挑取，接種到斜面培養(yǎng)基上，置25左右培養(yǎng)。待菌長(zhǎng)出后，檢查菌是否單純，

29、若有其他菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離純化，直到獲得純培養(yǎng)。(二)病原細(xì)菌的分離病原細(xì)菌的分離方法以稀釋分離法和劃線分離法為最常用。在進(jìn)行分離之前，首先應(yīng)對(duì)病組織材料進(jìn)行細(xì)菌學(xué)初步診斷，即經(jīng)過(guò)鏡檢確認(rèn)有噴菌現(xiàn)象以后，才對(duì)該病組織作分離工作。稀釋分離法是最經(jīng)典的標(biāo)準(zhǔn)分離法，方法同上述真菌分離。除去上述稀釋分離法以外，較為方便的是劃線分離法：(1) 預(yù)先把熔化好的肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝成平板后，翻轉(zhuǎn)放在30恒溫箱中24 h，使表面無(wú)水滴凝結(jié)。也可凝成平板后直接使用。(2) 將病組織先用0.1升汞表面消毒0.52 min，再用無(wú)菌水換洗3次后，放在滅菌培養(yǎng)皿中的滅菌水中，用滅菌玻棒研碎，并讓組織碎塊