肥達試驗和沉淀反應(yīng)實驗報告

1、實驗報告實驗名稱肥達試驗實驗日期院 系專 業(yè)班 級姓 名學(xué) 號一、實驗?zāi)康膶W(xué)會肥達反應(yīng)的原理、方法以及結(jié)果分析。理解肥達反應(yīng)在傷寒和副傷寒桿菌感染檢測中的應(yīng)用。二、實驗器材試劑：生理鹽水、患者血清、傷寒桿菌H菌液、傷寒桿菌O菌液、甲型副傷寒桿菌H液、乙型副傷寒桿菌H菌液器材：水浴鍋、冰箱、小試管32支、試管架、記號筆、移液槍三、實驗原理1.傷寒桿菌有三種抗原：分別為菌體抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）、體表抗原（Vi抗原）。其中以O(shè)抗原及H抗原的抗原性較強，而Vi抗原的抗原性不強，且相應(yīng)抗體效價低且為時短暫，隨細菌的消除而消失，故不列為肥達試驗的檢測項目。（但其檢查有助于發(fā)現(xiàn)傷寒帶菌者。）當

2、抗原遇到特異性抗體（抗O及抗H）時，便會發(fā)生凝集反應(yīng)，通過對凝集物量多少來推算病人體內(nèi)抗體的多少，以協(xié)助診斷、治療及判斷預(yù)后。2.用已知的傷寒沙門菌菌體（O）抗原和鞭毛（H）抗原，以及引起副傷寒的甲型副傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌H抗原的診斷菌液與受檢血清做試管或微孔板凝集實驗，測定受檢血清中有無相應(yīng)抗體及其效價的試驗。四、實驗過程及步驟1. 取清潔小試管32支，分成4排，每排8支，依次編號。2.32支小試管，用移液槍各注入0.5ml生理鹽水。3.第一管內(nèi)加入1：10稀釋的患者血清0.5ml，用1ml吸管吹吸三次，混勻，吸出0.5ml注入第二管作對倍稀釋，依次稀釋至第7管，棄去0.5ml，第8

3、管為對照。第二排、第三排、第四排以相同步驟加入患者血清。4. 第一排各管內(nèi)注入傷寒桿菌H菌液0.5ml；第二排各管注入傷寒桿菌O菌液0.5ml；第三排各加入甲型副作寒桿菌H液0.5ml；第四排各管加入乙型副傷寒桿菌H菌液0.5ml。5. 置于56水浴箱24小時。6.放冰箱過夜或放37水浴箱18小時后觀察結(jié)果。7. 結(jié)果觀察最強:上液澄清，細菌全部凝集沉淀于管底。強：上液輕度混濁，細菌大部分凝集沉淀于管底。弱：上液混濁，細菌少部分凝集。不凝：液體呈乳狀與對照管相同。五、實驗總結(jié)1.結(jié)果與分析：先觀察對照管，正確結(jié)果應(yīng)無凝集現(xiàn)象，再觀察各試驗管的凝集現(xiàn)象，凝集程度以“+”多少表示之。（+）最強，上

4、液澄清，細菌全部凝集沉淀于管底。（+）強，上液輕度混濁，細菌大部分凝集沉淀于管底。（+）弱，上液混濁，細菌少部分凝集。（-）不凝，液體呈乳狀與對照管相同。效價判定：以能出現(xiàn)“+”凝集現(xiàn)象的血清最高稀釋度為該血清的凝集效價。一般認為O抗體效價在1：80以上，H抗體效價在1：160以上，有輔助診斷意義。H甲或H乙達到1：80或以上具有診斷意義。但在分析結(jié)果時，應(yīng)注意以下兩點：（1）非腸熱癥患者，由于曾接種過傷寒，副傷寒疫苗或以往在流行區(qū)有過隱性感染或患過傷寒，副傷寒，以及回憶反應(yīng)等原因，也可呈現(xiàn)陽性結(jié)果。不過，由這些原因所引起的陽性反應(yīng)主要是H抗體升高，O抗體效價一般不高，同時，每隔57天試血一次

5、，其抗體效價一般不會隨病程而升高。上述這些都有別于現(xiàn)癥感染。（2）少數(shù)腸熱癥患者，由于發(fā)病初期曾使用大量抗生素，或機體有免疫缺陷病，或機體反應(yīng)性極弱等原因，抗體效價可以很低，甚至為陰性結(jié)果。因此不能只根據(jù)肥達氏試驗的結(jié)果去作簡單肯定或否定的結(jié)論，必須結(jié)合當?shù)亓餍星闆r，既往接觸史，以及臨床癥狀和體征，做出正確的判斷。2.肥達反應(yīng)的診斷標準：肥達反應(yīng)是診斷傷寒副傷寒的輔助診斷，其結(jié)果的解釋必須結(jié)合臨床變現(xiàn)和病程，病史，以及地區(qū)流行病學(xué)情況。機體患傷寒、副傷寒，一般于發(fā)病后12周內(nèi)血液中出現(xiàn)特異性抗體并且隨著病程延長而效價漸升，此時即可為陽性，第4周可達峰值，以后又逐漸降低。一般以“O”凝集效價在1

6、/80或以上和H”在1/160或以上為陽性。O抗體主要是IgM,出現(xiàn)較早；H抗體主要是IgG,出現(xiàn)較晚。根據(jù)此特點，肥達試驗結(jié)果有如下診斷價值：二者均超過正常值，患傷寒的可能性大；二者均在正常值內(nèi)，患傷寒的可能性??；H抗體效價超過正常值，O抗體效價正常，可能是接種了傷寒菌苗或者是接種的回憶反應(yīng)；O抗體效價超過正常值，H抗體效價正常，可能是傷寒早期或者其他沙門氏菌感染；一般間隔12周復(fù)查，若抗體效價比前次結(jié)果增高24倍，則具有診斷價值。六、教師評價實驗報告實驗名稱沉淀反應(yīng)實驗日期院 系專 業(yè)班 級姓 名學(xué) 號一、實驗?zāi)康恼莆諏α髅庖唠娪镜脑砗头椒?，了解其用途。二、實驗器材器材：電子天平、錐形瓶

7、、200ml量筒、藥匙、稱量紙、水浴鍋、微波爐、洗耳球、玻片、移液管、廢液缸、打孔器、膠頭滴管、移液槍、鑷子、紗布條、電泳槽試劑：pH8.6 0.05mol/L巴比妥緩沖液、瓊脂粉三、實驗原理1.對流免疫電泳也稱反向免疫電泳或免疫電滲電泳，其實質(zhì)是定向加速的電泳技術(shù)與免疫雙擴散技術(shù)的結(jié)合。抗原和抗體在一定的pH條件下，由于帶電荷量的多少及分子量大小不同，在電場中以不同的速度作定向移動。在pH8.6的緩沖液中，多數(shù)蛋白質(zhì)抗原物質(zhì)帶負電荷，在電場作用下向陽極移動；而其抗體大多為球蛋白，等電點較高，帶負電荷較少，且分子量較大，電泳速度慢，受電滲作用影響向負極移動。由于抗原抗體孔相對排列，當兩者比例適

8、當時，特異性抗原抗體互相結(jié)合形成肉眼可見的白色沉淀線。同時，由于電場限制了抗原抗體分子的自由擴散，從而提高了試驗的敏感性，且縮短了試驗時間。此法可用于抗原或抗體的快速診斷。但缺點是分辨力低，較復(fù)雜的抗原抗體系統(tǒng)不宜用此法。2.在一定溫度和電解質(zhì)存在的條件下，可溶性抗原與相應(yīng)抗體在比例合適處形成肉眼可見的沉淀線，稱為沉淀反應(yīng)(precipitationreaction)。參與反應(yīng)的抗原稱為沉淀原，抗體稱為沉淀素。可溶性沉淀原分子小，單位體積內(nèi)所含的抗原量多，與抗體結(jié)合的總面積大，故試驗時需對抗原進行稀釋，確?？乖c抗體以合適的比例結(jié)合，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應(yīng)的效價。目前廣泛應(yīng)用的沉淀反應(yīng)是

9、凝膠免疫擴散(Agargelimunodiffusion)。在凝膠內(nèi)電解質(zhì)的參與下，特異性抗原、抗體在凝膠內(nèi)擴散并相遇，免疫復(fù)合物在最適比例處（在平衡區(qū)帶，即抗體決定簇的數(shù)目等于抗原決定簇數(shù)目時）發(fā)生沉淀。常用的12瓊脂凝膠形成的構(gòu)架網(wǎng)孔較大，允許分子量在20萬以下的物質(zhì)（如絕大多數(shù)可溶性抗原和抗體）通過，在凝膠中自由擴散。而免疫復(fù)合物因顆粒較大不擴散，形成沉淀線。這種沉淀線是一組抗原抗體的特異性復(fù)合物。如果凝膠中有多種不同抗原抗體存在時，便依各自擴散速度的差異，在適當部位形成獨立的沉淀線，因此廣泛地用于抗原成分的分析。瓊脂擴散試驗可根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的方式和特性分為單向免疫擴散、雙向免疫擴散、

10、免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳、免疫固定電泳等試驗。以下為對流免疫電泳測定血清中的AFP。四、實驗過程及步驟任務(wù)一：制備巴比妥瓊脂板1.電子天平稱取0.500g瓊脂粉，加入錐形瓶，用量筒量取50ml pH8.6 0.05mol/L巴比妥緩沖液加入錐形瓶。混勻后微波爐加熱2分鐘。再放入56恒溫水浴鍋中。（0.05ml/LpH8.6巴比妥緩沖液的配制方法：巴比妥-1.84g；巴比妥鈉-10.3g；加蒸餾水至1000ml）2.取4.5ml 已融化的1%巴比妥瓊脂溶液滴于載玻片上提示：（1）所用載玻片要潔凈、邊緣無破損，否則難以澆制瓊脂板，可用75乙醇沖洗干凈，晾干備用。（2）吸取瓊脂溶液的量，太少

11、不能鋪滿整張玻片，太多將溢出玻片，都會導(dǎo)致瓊脂板制備失敗。（3）澆制瓊脂板時動作要迅速，過于緩慢容易邊加邊凝，使瓊脂板凹凸不平。任務(wù)二：打孔1.待瓊脂板凝固后在瓊脂板中間部分打四個孔，孔徑3mm，孔距10mm。在左上角打一個孔作為標記。用膠頭滴管吸去空上廢液。提示：（1）打孔時要小心，勿使瓊脂層脫離載玻片或瓊脂板底層開裂，以免加樣時順裂縫或底部散失。一旦出現(xiàn)裂縫或脫離現(xiàn)象，可向孔內(nèi)滴加少許溫瓊脂加以彌補或?qū)傊逶诨鹧娓咛巵砘赝ㄟ^幾次補底。（2）在瓊脂板左上角打上標記孔，有助于確定正負極方向和樣本上樣位置，通常情況下，有標記孔側(cè)，放置于正極端。任務(wù)三：加樣1.如下圖所示加樣，用移液槍每個孔加1

12、0微升對應(yīng)液體：C：人待測血清； D：人陽性血清； E：抗人血清抗體/診斷血清提示：（1）抗原和抗體在一定的pH條件下，由于帶電荷量的多少及分子量大小不同，在電場中以不同的速度作定向移動。在pH8.6的緩沖液中，多數(shù)蛋白質(zhì)抗原物質(zhì)帶負電荷，在電場作用下向陽極移動，而其抗體大多為Y球蛋白，等電點較高，帶負電荷較少，且分子量較大，電泳速度慢，受電滲作用影響向負極移動。（2）加樣時勿使樣品外溢或在邊緣殘存小氣泡，以免影響擴散結(jié)果。（3）抗原、抗體的量應(yīng)相接近時容易出現(xiàn)沉淀帶，反之不易發(fā)生，如抗原過多，可造成假陰性結(jié)果，可通過稀釋抗原加以解決。任務(wù)四：正確放置瓊脂板至電泳槽1.向電泳槽中加入約2/3體積的pH8.6 0.05mol/L巴比妥溶液，將加好樣的瓊脂板放入電泳槽，有標記孔的一側(cè)放在正極端。2.用紗布條搭在瓊脂板兩側(cè)，以便電泳。提示：（1）電泳時抗原、抗體電極方向不可放反。（2）搭橋時應(yīng)注意與凝膠接觸緊密，否則會使電流不均勻，致使沉淀線歪斜、不均勻