HPLC硬件構(gòu)造上課講義

1、HPLC,的結(jié)構(gòu)、原理及,日常維護(hù),劉浩然,2013.03.30,內(nèi)容簡(jiǎn)介,HPLC,的硬件結(jié)構(gòu),HPLC,的原理,HPLC,日常維護(hù)要點(diǎn),一、概,述,HPLC,即,High performance liquid,chromatography,或,High pressure liquid,chromatography,譯為：高效液相或高壓液相,HPLC,是,20,世紀(jì),60,70,年代發(fā)展起來(lái)的分離分析,工具。是有機(jī)化合物分析、藥物分析的常用儀器,約,80,左右的藥物可用,HPLC,檢測(cè),二,HPLC,主要知名品牌,沃特斯,Waters,安捷倫,Agilent,島津,Shimazu,其它：戴安

2、、菲尼根、熱電等,三,HPLC,的基本結(jié)構(gòu),分離部分,分析部分,控制部分,常見(jiàn),HPLC,結(jié)構(gòu)外觀,島津,LC-20A,Waters,機(jī),型,Waters,機(jī)型,Thermo fisher,液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用,大連依利特,北京普源精電,北京北分,上海伍豐,江蘇天瑞,LC310,FL2200,浙江福立,北京東西分析,萊伯泰科,HPLC,HPLC,結(jié)構(gòu)的幾種形式,串聯(lián)式二元高壓泵系統(tǒng),并聯(lián)式二元高壓泵系統(tǒng),四流路串聯(lián)式單高壓泵系統(tǒng),HPLC,的不同類型主要在于高壓輸液泵的區(qū)別,通常有以下幾種形式,串聯(lián)式二元高壓泵,HPLC,結(jié)構(gòu)示意圖,分離部分,分離部分由,高壓輸液泵,色譜柱,及相關(guān)組,件組成,由高

3、壓輸液泵吸取流動(dòng)相，使之進(jìn)入色譜,柱，由,進(jìn)樣器,注入樣品后，由色譜柱進(jìn)行,分離,在高壓輸液泵之前常用,脫氣機(jī),在色譜柱部分要裝,柱溫箱,保持色譜柱的溫,度恒定,高壓輸液泵,目前,HPLC,配備高壓輸液泵大致有兩種類型,一種是,兩個(gè)高壓輸液泵,各自輸送流動(dòng)相后進(jìn)入混合器,俗稱“二元高壓泵,另一種是只有,一個(gè)高壓輸液泵,在這個(gè)輸液泵之前配備,一,個(gè)電磁閥,控制流路，通常這種形式的泵有四個(gè)流路。俗稱,四元低壓泵”。但其實(shí)質(zhì)上仍是,單泵,本室有兩臺(tái)島津的,HPLC,均為四元低壓的單泵。有兩臺(tái),安捷倫,HPLC,其中一臺(tái)為四元低壓的單泵，另一臺(tái)為二,元高壓泵,高壓輸液泵（外觀,高壓輸液泵（內(nèi)部,排空閥

4、,高壓輸液泵,高壓泵（一個(gè)，串聯(lián)式,裝電磁閥的部位,泵傳動(dòng)的帶齒皮帶,俯視圖（內(nèi)部,高壓輸液泵原理,單向閥的工作原理,紅寶石,正,向,反,向,單向閥實(shí)物,為何有兩個(gè)泵頭，卻只能算是一個(gè)泵,在同一個(gè)軸上有,兩個(gè)相位相差,180,度,的偏心輪，當(dāng)其,中一個(gè)吸液時(shí)，另一個(gè)排液,交替進(jìn)行,這樣就減,少了輸液的脈動(dòng),排空閥,Purge,閥）起什么作用,Purge,閥,Purge,閥主要用于兩個(gè)方面,1,剛開機(jī)時(shí)，要打開,Purge,閥,逆時(shí)針?lè)较驍Q,180,度,啟動(dòng),高壓輸液泵沖洗約,5min,排掉一段流動(dòng)相以去除管,腔中的氣泡,2,更換不同的流動(dòng)相時(shí)，要將前面一段流動(dòng)相排盡,開啟,Purge,閥時(shí)，一

5、般用較高的流速,5ml/min,來(lái)沖洗,管腔,混合器,混合器,混合器的作用,混合器主要是用來(lái)混勻流動(dòng)相的,流動(dòng)相不均勻?qū)z測(cè)影響很大,混合器通常是通過(guò)一些,U,形管來(lái)使流動(dòng)相混,勻，即“蛇形管”模式。也有的是采用一,些過(guò)濾介質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由于在混合過(guò)程中,沒(méi)有動(dòng)力裝置，故稱為“靜態(tài)混合,此外，好的混合器可使儀器系統(tǒng)壓力比較,恒定,島津,20AT,型,HPLC,輸液泵,脫氣機(jī),手動(dòng)進(jìn)樣器,柱溫箱,差示折光檢測(cè)器,紫外檢測(cè)器,混合器,脫氣機(jī),脫氣機(jī)原理,為什么要脫氣,因?yàn)榱鲃?dòng)相中可溶解一定的空氣,如果不脫氣，在檢測(cè)器中氣泡會(huì)冒出來(lái)，嚴(yán)重影,響檢測(cè)基線,脫氣機(jī)由真空泵、真空度檢測(cè)器及脫氣腔組成,流動(dòng)相

6、通過(guò)含氟樹脂為材料的管狀膜，其中的氣,體可通過(guò)膜被真空泵抽去，而液體保留下來(lái),脫氣機(jī)內(nèi)部構(gòu)造,島津儀器將柱溫箱和手,動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)計(jì)為一體,這一設(shè)計(jì)的最大弊,端是維護(hù)手動(dòng)進(jìn)樣器十,分不便,7725i,手動(dòng)進(jìn)樣閥原理,7725i,手動(dòng)進(jìn)樣閥實(shí)圖,柱溫箱,柱溫箱是保障色譜柱在恒定的溫度下工作,的前提條件，也是,HPLC,結(jié)果重現(xiàn)性的保,障,沒(méi)有柱溫箱是很難進(jìn)行定性定量分析,的因?yàn)闇囟瓤捎绊懳镔|(zhì)的保留時(shí)間，峰,形等參數(shù),除制備型,HPLC,以外，一般分析型,HPLC,都,要有柱溫箱,國(guó)產(chǎn)柱溫箱,安捷倫自帶的臥式柱溫箱,色譜柱,色譜柱可分為正相色譜柱、反相色譜柱,特殊專用柱（手性色譜柱、離子色譜柱,氨基酸

7、分析柱、糖類分析柱等,操作儀器前一定要認(rèn)清是什么型號(hào)、什么,材質(zhì)的色譜柱！否則，亂用流動(dòng)相，一次,就可導(dǎo)致色譜柱報(bào)廢,如：環(huán)糊精為填料,的手性色譜柱，如果流動(dòng)相含有水，即可,溶解，一次性報(bào)廢,反相色譜柱,目前最常用的為反相色譜柱,反相色譜柱一般是以硅膠顆料上鍵合,C18,C8,而成。常用的為,C18,C18,反相色譜柱適合分離很多物質(zhì)，且色譜,柱較為耐用,C18,注意事項(xiàng),但流動(dòng)相,PH,值一定要保證在,28,之間。低于,或高于，色譜柱即遭破壞,反相色譜柱一定不能用純水作流動(dòng)相，否,則鍵合的,C18,坍塌，報(bào)廢,流動(dòng)相中水的比例最大為,90,液相色譜柱,色譜柱不能震動(dòng)、跌落,色譜柱不用時(shí)，從儀

8、器上取下后要用適當(dāng),的溶劑保存，并在兩端擰上堵頭,紅,色,部,分,即,為,堵,頭,如何認(rèn)識(shí)不同型號(hào)儀器的構(gòu)造,無(wú)論何種,HPLC,其結(jié)構(gòu)總離不開高壓輸液,泵、進(jìn)樣器、柱溫箱、檢測(cè)器幾個(gè)部分,搞清儀器不同部分的作用是做好實(shí)驗(yàn)和維,護(hù)儀器的前提,共用一個(gè)機(jī)箱的串聯(lián)式二元高壓輸液泵,典型代表是安捷倫,安捷倫,1200,內(nèi)部構(gòu)造,二元高壓輸液泵的,HPLC,Agilent,并聯(lián)式二元高壓輸液泵,這種形式的輸液泵制造工藝要求比串聯(lián)泵,更高,Waters,公司是以做并聯(lián)泵為主要產(chǎn)品的,島津近期也推出了并聯(lián)泵產(chǎn)品，如,LC,20AD,國(guó)產(chǎn),HPLC,中只有極少數(shù)廠家生產(chǎn)：如：上,海伍豐、江蘇天瑞等,二元高壓

9、,并聯(lián)泵,HPLC,結(jié)構(gòu)示意圖,貯液瓶,高壓輸液泵,脫氣機(jī),檢測(cè)器,色譜柱,柱溫箱,混合器,進(jìn)樣器,電,腦,廢液瓶,并,聯(lián),泵,結(jié),構(gòu),的,高,效,液,相,四流路單高壓輸液泵的,HPLC,典型代表為安捷倫,二元高壓,并聯(lián)泵,HPLC,結(jié)構(gòu)示意圖,貯液瓶,高壓輸液泵,電磁閥,檢測(cè)器,色譜柱,柱溫箱,混合器,進(jìn)樣器,電,腦,廢液瓶,脫氣機(jī),安捷倫,1100,整體結(jié)構(gòu),安捷倫,1100,內(nèi)部構(gòu)造,四元低壓,單泵,的,HPLC,Agilent,高壓輸液泵,電磁閥（含四個(gè)流路,分析部分,分析部分主要就是由,檢測(cè)器,組成,常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、差示折光檢,測(cè)器、熒光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器,等,紫外檢

10、測(cè)器最為常用。它又可分為可變波,長(zhǎng)檢測(cè)器,VWD,和二極管陣列檢測(cè)器,PDA,紫外檢測(cè)器（外觀,紫外檢測(cè)器（內(nèi)部,流通池,紫外可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器示意圖,紫外可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器獲得的色譜圖,光電二極管陣列,DAD,檢測(cè)器,DAD,檢測(cè)器仍然屬于紫外檢測(cè)器,與普通紫外可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器不同的是，它,的二極管有,512,個(gè)，可同時(shí)采集不同波長(zhǎng)下,的紫外吸收信號(hào),普通紫外可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器是先分光，再通,過(guò)流通池,DAD,是混合光先通過(guò)流通池,再分光,光電二極管陣列檢測(cè)器,DAD,DAD,檢測(cè)器,DAD,檢測(cè)器可作三維色譜圖,DAD,檢測(cè)器與普通紫外檢測(cè)器的對(duì)比,DAD,檢測(cè)器,能在檢測(cè)色譜峰的同時(shí)獲得光譜,便于,定

11、性,普通紫外,是先分光，再通過(guò)流通池，因?yàn)槭菃问?光，所以,靈敏度高,DAD,檢測(cè)器是先通過(guò)流通池，再分光，因?yàn)槭腔?合光，所以靈敏度低,一般比普通紫外靈敏底低,一個(gè)數(shù)量級(jí),差示折光檢測(cè)器,主要用于無(wú)紫外吸收的糖類檢測(cè),控制部分,控制部分主要就是工作站。工作站由硬件,和軟件兩部分組成,硬件一般是一塊可雙向傳輸數(shù)據(jù)的板卡,安裝于電腦主機(jī)上,軟件則是與相應(yīng)機(jī)型配套的程序,有一些軟件還要一個(gè)“加密狗”，外形類,似于,U,盤。沒(méi)有“加密狗”，軟件就不能運(yùn),行,HPLC,操作注意事項(xiàng),使用,HPLC,之前必須熟悉相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)。包,括儀器構(gòu)造、流動(dòng)相的選擇、色譜柱的保,養(yǎng)等,必須經(jīng)過(guò)培訓(xùn)方可獨(dú)立操作,做,

12、HPLC,的“四項(xiàng)基本原則,流動(dòng)相和樣品必須微孔濾膜,過(guò)濾,開機(jī)初始一定要,排,除流動(dòng)相,氣,泡,檢測(cè)前一定要,平衡,儀器,測(cè)完樣品一定要,沖,洗色譜,柱,堅(jiān)持這四項(xiàng)基本原則，液相一般不會(huì)出現(xiàn)重大問(wèn)題,流動(dòng)相的選擇,不同的液相流動(dòng)相不同。主要是根據(jù)色譜柱和檢,測(cè)器來(lái)選擇。千萬(wàn)不要認(rèn)為所有液相的流動(dòng)相是,通用的,以常用的紫外檢測(cè)器反相高效液相色譜為例，常,用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈及水或緩沖鹽,思考：為何選擇甲醇、乙腈為流動(dòng)相,流動(dòng)相用緩沖鹽注意事項(xiàng),緩沖鹽易于在柱塞桿上析出，對(duì)柱塞桿及,柱塞桿密封圈磨損極大，如果沒(méi)有及時(shí)清,洗，會(huì)導(dǎo)到高壓輸液泵漏液,除非萬(wàn)不得已，盡量不用緩沖鹽,如果要用緩沖鹽，盡

13、量,用揮發(fā)性緩沖鹽,如：醋酸醋酸銨,不要用非揮發(fā)性,緩沖鹽（如,磷酸緩沖鹽,人造寶石材質(zhì),柱塞桿密封圈（俗稱“黑草帽”,流動(dòng)相的過(guò)濾,流動(dòng)相必須用,0.22um,的微孔濾膜過(guò)濾,微孔濾膜有兩種，一種為有機(jī)相使用的,另一種為水相使用的，不可混用,有機(jī)相的膜一般為尼龍膜，水相的膜一般,為混合醋酸纖維素酯膜,用于流動(dòng)相過(guò)濾的濾膜直徑為,50mm,流動(dòng)相過(guò)濾裝置,樣品的過(guò)濾,樣品必須用,0.22um,的微孔濾膜過(guò)濾,微孔濾膜有兩種，一種為有機(jī)相使用的，另一種,為水相使用的，不可混用,有機(jī)相的膜一般為聚偏氟乙烯膜，水相的膜一般,為混合醋酸纖維素酯膜,用于流動(dòng)相過(guò)濾的濾膜通常直徑為,13mm,為減少交叉污染，樣品常用,一次性過(guò)濾頭,過(guò)濾,用一次性過(guò)濾頭過(guò)濾樣品,測(cè)樣前的準(zhǔn)備,開啟儀器。將逆時(shí)針將,Purge,閥旋轉(zhuǎn),180,度,啟動(dòng)高壓輸液泵，以,5ml/min,的流速?zèng)_洗,35min,以除去管路中的氣泡,打開紫外檢測(cè)器，監(jiān)測(cè)基線，至少使之平,衡半小時(shí),切換至所需的色譜條件直到基線平穩(wěn)之后,再進(jìn)樣,一定要采用進(jìn)口的進(jìn)樣針,具體操作再進(jìn)行詳細(xì)培訓(xùn),測(cè)樣后沖洗色譜柱,每天測(cè)完樣品后必須沖洗色譜柱,常用的反相色譜柱的沖洗方法為：以甲醇（或乙,腈）：水,10,90,沖洗色譜柱