抗體純化大全

1、抗體的純化第一節(jié) 硫酸銨沉淀法基本原理硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)。用此方法可以將主要的免疫球蛋白從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來(lái)。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來(lái)沉淀不同的蛋白質(zhì)。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來(lái)表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用最廣。試劑及儀器 組織培養(yǎng)上清液、血清樣品或腹水等 硫酸銨（NH4）SO4 飽和硫酸銨溶液（SAS） 蒸餾水 PBS(含0.2g/L疊氮鈉) (見(jiàn)附錄一

2、) 透析袋 超速離心機(jī) pH計(jì) 磁力攪拌器實(shí)驗(yàn)步驟以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來(lái)介紹抗體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析所需硫酸銨的飽和度也不完全相同。通常用來(lái)分離抗體的硫酸銨飽和度為33%50%。一、配制飽和硫酸銨溶液（SAS）將767g（NH4）2SO4 邊攪拌邊慢慢加到1升蒸餾水中。用氨水或硫酸調(diào)到pH7.0。此即飽和度為100%的硫酸銨溶液（4.1 mol/L, 25C）；其它不同飽和度硫酸銨溶液的配制見(jiàn)表1；二、沉淀1、樣品（如腹水）20 000g 離心30 min，除去細(xì)胞碎片；2、保留上清液并測(cè)量體積；3、邊攪拌邊慢慢加入等體積的SAS到上清液中，終濃度為1：1（v/v）；4

3、、將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時(shí)或攪拌過(guò)夜（4C），使蛋白質(zhì)充分沉淀。三、透析1、蛋白質(zhì)溶液10 000g 離心30 min（4C）。棄上清保留沉淀；2、將沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L疊氮鈉中。沉淀溶解后放入透析袋對(duì)PBS-0.2g/L 疊氮鈉透析24-48小時(shí)（4C），每隔3-6 小時(shí)換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸氨；3、透析液離心，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量。應(yīng)用提示一、先用較低濃度的硫酸氨預(yù)沉淀，除去樣品中的雜蛋白。1、邊攪拌邊慢慢加SAS到樣品溶液中，使?jié)舛葹?.5:1 (v/v)；2、將溶液放在磁力攪拌器上攪拌6小時(shí) 或過(guò)夜（4C）；3、3000g 離心30 m

4、in（4C），保留上清液；4、上清液再加SAS到0.5:1 (v/v)，再次離心得到沉淀。將沉淀溶于PBS，同前透析，除去硫酸氨；5、雜蛋白與欲純化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差別很大時(shí)，用預(yù)沉淀除雜蛋白是非常有效的；二、為避免體積過(guò)大，可用固體硫酸氨進(jìn)行鹽析（硫酸氨用量參考表1）；三、硫酸氨沉淀法與層析技術(shù)結(jié)合使用，可得到更進(jìn)一步純化的抗體。參考文獻(xiàn)1、 Burd, R.S., Raymond, C.S., Ratz, C. A and Dunn, D.L (1993) A rapid procedure for purifying IgM monoclonal antibodies from

5、murine ascites using a DEAE disk. Hybridoma 12, 135.2、 T.G.庫(kù)珀著，徐曉利主譯生物化學(xué)工具 人民衛(wèi)生出版社出版（1980），353。（夏泉）表1.室溫下硫酸氨飽和度由起始濃度（S1）提高到終濃度（S2）時(shí)需加硫酸氨的量（g/L）0%10%20%25%30%33%35%40%45%50%55%60%65%70%75%80%90%56 114 144 176 196 209 243 277 313 351 390 430 472 516 561 662 76757 86 118 137 150 183 216 251 288 326 365

6、 406 449 494 592 64929 59 78 91 123 155 189 225 262 300 340 382 424 520 61930 49 61 93 125 158 193 230 267 307 348 390 485 58319 30 62 94 127 162 198 235 273 314 356 449 54612 43 74 107 142 177 214 252 292 333 426 52231 63 94 129 164 200 238 278 319 411 50631 63 97 132 168 205 245 285 375 46932 65 9

7、9 134 171 210 250 339 43133 66 101 137 176 214 302 39233 67 103 141 179 264 35334 69 105 143 227 31434 70 107 190 27535 72 153 23736 115 19877 15779第二節(jié) DEAE離子交換層析法基本原理離子交換層析是蛋白質(zhì)純化的常規(guī)方法，與硫酸氨沈淀法聯(lián)合使用可以非常有效地純化抗體。DEAE是一種陰離子交換劑，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液通過(guò)DEAE柱時(shí)，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)可以被DEAE吸附，帶正電荷的蛋白質(zhì)則不被吸附而隨溶液流出。純化抗體時(shí)可選擇pH值大于待純化抗體等電點(diǎn)的緩沖液

8、，此時(shí)抗體帶負(fù)電荷可以通過(guò)電價(jià)鍵吸附于DEAE離子交換劑上，然后用增加鹽濃度的方法將抗體洗脫?？梢杂眠B續(xù)梯度法洗脫，也可以用不連續(xù)梯度（分段洗脫）法洗脫。本文以腹水中mAb的純化為例來(lái)介紹此方法。試劑及儀器 抗體樣品（小鼠腹水或經(jīng)硫酸氨沉淀的抗體） DEAE離子交換劑（陰離子交換劑） 層析柱（2.5cm 20 cm） 緩沖液 A：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +35 mmol /L NaCl 緩沖液 B：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +70mmol /L NaCl 緩沖液 C：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 +500 mmol /L N

9、aCl 緩沖液 D：25mmol/L Tris-HCl pH 8.8 PBS (見(jiàn)附錄一) 透析袋 (MW CO 10 000) 磁力攪拌器 蠕動(dòng)泵和部分收集器 紫外檢測(cè)儀 梯度發(fā)生器 電導(dǎo)儀 pH計(jì) 離心機(jī)實(shí)驗(yàn)步驟整個(gè)層析過(guò)程最好在4C 進(jìn)行,可在冷室操作；1、抗體樣品對(duì)緩沖液B 透析過(guò)夜（4C）；2、按說(shuō)明處理DEAE離子交換劑。然后用緩沖液A 平衡。用20倍體積緩沖液A洗交換劑，可用過(guò)濾或離心法反復(fù)洗到流出液的電導(dǎo)率等于緩沖液A；3、將處理好的DEAE離子交換劑懸浮在緩沖液A 中，裝入層析柱。4、用等體積的緩沖液D 稀釋透析過(guò)的抗體樣品，使之與緩沖液A 的離子強(qiáng)度一致；5、稀釋后的樣品1

10、0 000g 離心10 min（4C），除去沉淀變性的蛋白質(zhì)；6、層析柱與蠕動(dòng)泵、部分收集器及紫外檢測(cè)儀連接；7、抗體樣品以1ml/min 流速上柱，然后用緩沖液A 洗柱1ml/min，將未吸附的蛋白質(zhì)洗出。直到流出液在280 nm 的吸光度小于0.05；8、吸附的蛋白質(zhì)，用連續(xù)增加NaCl的濃度來(lái)洗脫。用線性梯度緩沖液（35-500 mmol/L NaCl）或分段緩沖液（35、70、140、280、500 mmol/L NaCl）洗脫。流速1ml/min ，分部收集洗脫液 2ml / 管 （圖2-4-1）；9、椐紫外檢測(cè)結(jié)果，將抗體峰部分合并。裝入透析袋對(duì)PBS(含0.2g/L疊氮鈉)4C

11、透析或冷凍（視抗體的穩(wěn)定性而定）；10、 DEAE離子交換劑可按照商品說(shuō)明再生使用。圖2-4-1 DEAE離子交換柱層析純化小鼠IgG流速：1ml/min 樣品：0.5ml腹水檢測(cè)方法1、大部分小鼠的單克隆抗體IgG可在50200mmol/L NaCl濃度之間洗脫。2、可用SDS-PAGE 或定量免疫學(xué)方法（RIA、ELISA）檢測(cè)各部分洗脫液的抗體存在及效價(jià)。實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說(shuō)明1、要得到滿意的分離結(jié)果，每ml DEAE 離子交換劑所加樣品中蛋白質(zhì)總量最好不超過(guò)10mg。2、用經(jīng)硫酸銨沉淀初步純化的抗體代替小鼠腹水作為樣品，可得到更好的純化結(jié)果。3、如抗體與DEAE離子交換劑不能有效的結(jié)合，可將起

12、始緩沖液的pH提高0.1個(gè)單位,直到可以有效結(jié)合為止。4、如果沒(méi)有合用的蠕動(dòng)泵和部分收集器，可用手工上樣和收集。洗脫液每管收集0.5-2ml ,然后用分光光度計(jì)測(cè)定各管280nm波長(zhǎng)的吸光度值。5、該方法可按比例擴(kuò)大。用適合于高流速的大柱和相應(yīng)的交換劑來(lái)純化大量的蛋白質(zhì)樣品。參考文獻(xiàn)1. Corthier, G., Boschetti, E. and Charley-Poulain, J. (1984) Improved method for IgG purification from various animal species by ion exchange chromatography

13、J. Immunol. Meth . 66, 75-79.2、張保真編譯西安醫(yī)科大學(xué)出版（1986）免疫組織化學(xué)理論與技術(shù) 69-71。（夏泉）第三節(jié) 羥磷灰石層析純化抗體基本原理羥磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2吸附蛋白質(zhì)的機(jī)理，通常認(rèn)為與其晶體表面的Ca2+ 和PO43- 兩種基團(tuán)相關(guān)。因?yàn)閹щ娀鶊F(tuán)緊密排列于晶體表面，可能通過(guò)偶極子之間的相互作用來(lái)吸附蛋白質(zhì)。樣品被吸附劑吸附后，用適當(dāng)?shù)南疵撘海ㄝ^高濃度的鹽溶液）沖洗，可使之解析。解析下來(lái)的物質(zhì)在流經(jīng)層析柱的過(guò)程中向前移動(dòng)，遇到前面新的吸附劑可再被吸附。在反復(fù)的吸附解析再吸附再解析的過(guò)程中，由于待分離物質(zhì)與吸附劑之間的吸附能力不同，它們

14、沿洗脫液流動(dòng)方向移動(dòng)的速度也不相同，所以在洗脫過(guò)程中各組分便會(huì)由于移動(dòng)速度不同而被分離?？贵w與其它蛋白質(zhì)一樣可以用羥磷灰石吸附柱層析進(jìn)行純化。試劑及儀器 抗體樣品（腹水或培養(yǎng)上清液） 羥磷灰石（Hydroxylapatite 有售） 層析柱（2.5cm 20 cm） 吸附緩沖液：20mmol/L 磷酸鉀緩沖液pH6.8 含30mmol /L NaCl 洗脫緩沖液：500mmol/L 磷酸鉀緩沖液pH6.8 含30mmol /L NaCl PBS (見(jiàn)附錄1) 透析袋 (MW CO 10 000) 磁力攪拌器 蠕動(dòng)泵和部分收集器 紫外檢測(cè)儀 梯度發(fā)生器 離心機(jī)實(shí)驗(yàn)步驟1、羥磷灰石柱的準(zhǔn)備：將羥磷

15、灰石懸浮于吸附緩沖液中，使之充分水合后裝柱。用10 柱體積的吸附緩沖液洗柱；2、樣品的預(yù)處理：含抗體的樣品先在4C對(duì)吸附緩沖液透析過(guò)夜或用該緩沖液10倍稀釋，再將透析或稀釋后的樣品4 000g 離心15min（4C）；3、儀器安裝：將蠕動(dòng)泵、紫外檢測(cè)儀和部分收集器與層析柱連接；4、上樣：將樣品上清液以1ml/min的流速加到柱上，然后用20 柱體積的吸附緩沖液洗柱；5、抗體的洗脫：提高磷酸鹽的濃度可以將抗體洗脫。常用的方法有兩種：一種是用梯度發(fā)生器進(jìn)行線性濃度梯度洗脫，濃度為20500 mmol/L的磷酸鉀緩沖液；另一種方法是用不連續(xù)濃度梯度洗脫，例如可以用35、70、140、280和500

16、mmol/L的磷酸鉀緩沖液依次分段洗脫。收集洗脫液 2ml / 管（圖2-4-2）；6、合并洗脫液中含抗體的部分（見(jiàn)下面檢測(cè)）對(duì)PBS透析。根據(jù)抗體的穩(wěn)定性4C或冷凍防腐（0.2g/L 疊氮鈉）保存；圖2-4-2 羥磷灰石柱層析純化單克隆抗體IgG流速：1ml/min 樣品：腹水1ml檢測(cè)方法1、 單克隆抗體IgG通常在200400mmol/L磷酸鉀濃度之間洗脫。2、 可用SDS-PAGE 或定量免疫學(xué)方法（RIA、ELISA），檢測(cè)各部分洗脫液的抗體。應(yīng)用提示1、每100ml 羥磷灰石可吸附大約500 ml細(xì)胞培養(yǎng)上清液或3 ml 的腹水或血清中所含的抗體。2、使用羥磷灰石柱較適合的 柱長(zhǎng)/

17、直徑 可以在5/115/1之間（典型尺寸：2.5cm 20 cm 柱長(zhǎng)）。3、在吸附過(guò)程中應(yīng)避免有對(duì)鈣的親和力大于磷酸鹽的物質(zhì)（如EDTA和檸檬酸等）的存在，以免減少羥磷灰石的吸附容量。4、用過(guò)的羥磷灰石柱可以用吸附緩沖液平衡再生后重復(fù)使用。或加入甲苯（0.03%， v/v)或疊氮鈉（0.2g/L）儲(chǔ)存。5、如果沒(méi)有合適的蠕動(dòng)泵和部分收集器，可手工加樣和收集洗脫液2ml / 管，并用分光光度計(jì)測(cè)定各管在 280nm 波長(zhǎng)的吸光度。6、與本方法類似的吸附和洗脫過(guò)程也可用來(lái)純化其它蛋白質(zhì)。參考文獻(xiàn)Bukovsky, J. and Kennett, R.H. (1987) Simple and ra

18、pid purification of monoclonal antibodies from cell culture supernatant and ascites fluids by hydroxylapatite chromatography on analytical and preparative scales. Hybridoma 6 ,219-228.（夏泉）第四節(jié) 抗體的辛酸純化法基本原理在人、羊或兔血清或 含有IgG的培養(yǎng)上清中及小鼠的腹水中加入辛酸, 可與其中大部分蛋白質(zhì)形成沉淀，而對(duì)IgG的性質(zhì)沒(méi)有影響，因此是純化IgG的有效途徑。沉淀后經(jīng)離心即可獲得IgG。辛酸沉淀法與

19、硫酸銨沉淀法比較其主要優(yōu)點(diǎn)為可減少聚合物的形成，但與其相同，所得的抗體純度不夠，還需用其它方法以進(jìn)一步提高其純度。試劑及儀器s 腹水或細(xì)胞培養(yǎng)上清s 0.06 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.0）（見(jiàn)附錄1）s 1N HCls 辛酸（ 正-八碳酸，n-octanoic acid）s 1N NaOHs PBS（見(jiàn)附錄）s 透析袋 （MWCO 10,000）s 電磁攪拌器s 離心機(jī)操作步驟1 用燒杯加20ml 0.06 mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.0）到10ml腹水或細(xì)胞培養(yǎng)上清中；2 用1N HCl調(diào)節(jié)pH到4.8，后滴加辛酸同時(shí)用力攪拌，具體用量參見(jiàn)表1；3 在室溫下繼續(xù)攪拌30分；4 5

20、，000 g 室溫離心30分，保留上清；5 用1N NaOH 調(diào)節(jié)pH到5.7；6 含有IgG的上清對(duì)PBS透析，然后分裝、置-20保存。表1 沉淀不同來(lái)源IgG的辛酸參考用量IgG來(lái)源 辛酸用量（每10ml腹水或上清）小 鼠 400l人 700l羊 700l兔 750l質(zhì)量檢察上清中IgG的純度可用SDS-PAGE分析及合適的酶標(biāo)免疫測(cè)試法測(cè)定其免疫活性來(lái)確定。上清中可能存在少量雜質(zhì)，可通過(guò)DEAE離子交換層析除去。參考文獻(xiàn)1. Russo,C., Callegaro,L.,Lanza,E., and Ferrone,S. (1983) Purification of IgG monoclo

21、nal antibody by caprylic acid precipitation. J. Immunol. Meth. 65,269-2712. Steianbuch,M. and Audran,R. (1969) The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid. Arch.Biochem.Biophys. 134, 279-284（朱正美）第五節(jié) Sephadex凝膠過(guò)濾純化抗體基本原理凝膠過(guò)濾又稱分子篩層析。是一種借助分子篩效應(yīng)將分子大小不同的混合物進(jìn)行分離的方法。交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephad

22、ex是常用的層析介質(zhì)。它是一種含有許多網(wǎng)眼的球形小顆粒，網(wǎng)眼大小分布均一。當(dāng)分子大小不同的混合物通過(guò)凝膠柱時(shí)，其中較大的分子不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)眼，將毫無(wú)阻力或阻力很小地隨洗脫液流出，而小分子物則能擴(kuò)散進(jìn)入網(wǎng)眼，被阻滯在層析柱上，分子量越小，擴(kuò)散出來(lái)所耗時(shí)間就越長(zhǎng)。因此分子大小不同的MoAb可以借助分子篩效應(yīng)進(jìn)行分離提純。本文以IgM的純化為例介紹此方法。IgM因分子特別大（900 kd）而不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，可首先被洗脫達(dá)到初步純化的目的。試劑和器材 Sephadex G 100 或G 200 粗制IgM-MoAb培養(yǎng)物或抗血清，腹水等 洗脫緩沖液：0.01mol/L Tris-HCl緩沖液p

23、H 8.0 含0 .5mol /L NaCl 層析柱（1.0 cm 30 cm或1.5cm 40 cm） 透析袋 (MW CO 10 000) 磁力攪拌器 部分收集器 紫外檢測(cè)儀 離心機(jī)步驟1、 樣品處理：將腹水、抗血清或培養(yǎng)上清液離心4000g 20分鐘，以除去細(xì)胞碎片。較稠的腹水和血清需適當(dāng)稀釋；2、 裝柱：根據(jù)樣品量選擇合適的層析柱，將0.01mol/L pH 8.0 含0 .5mol /L NaCl的Tris-HCl緩沖液加到柱長(zhǎng)的1/4處，然后將漂洗溶漲的Sephadex G 100 或G 200 傾入柱中，自然沉降30分鐘， 再用同樣的緩沖液平衡柱1小時(shí)，流速0.5ml/min；3

24、、 儀器連接：將紫外檢測(cè)儀和部分收集器與層析柱連接；4、 上樣和洗脫：待柱上平衡緩沖溶液接近凝膠上表面時(shí)，緩慢加入樣品溶液0.5ml/min。當(dāng)樣品液 面接近凝膠上表面時(shí)，加少量緩沖液清洗柱壁，然后接上緩沖液洗脫并收集1-2 ml/管。280nm 檢測(cè)的第一蛋白峰即為IgM-MoAb。5、濃縮與保存：將280nm檢測(cè)的第一蛋白峰合并，移入透析袋在磁力攪拌器上4C對(duì)PBS流動(dòng)透析過(guò)夜。透析后的溶液可經(jīng)聚乙二醇或五氧化二磷真空干燥濃縮后，分裝封管，-20C保存?zhèn)溆?。檢測(cè)1、可用SDS-PAGE 或定量免疫學(xué)方法（RIA、ELISA）檢測(cè)各部分洗脫液的抗體。2、IgM-MoAb一般在外水體積洗脫。應(yīng)

25、用提示1、凝膠過(guò)濾不變換洗脫液，一次裝柱后可反復(fù)使用多次。操作簡(jiǎn)單，快速經(jīng)濟(jì)。2、實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性高，樣品回收幾乎可達(dá)100%，且方法溫和，不易引起生物樣品變性失活，可進(jìn)行大量樣品的分離純化。3、用于小分子物（如無(wú)機(jī)鹽）從大分子物（MW20 000）分離的層析柱，柱體積應(yīng)大于樣品體積4-10倍，其高與直徑的比例應(yīng)為5:1-15:1；用于大分子物之間的分離（如免疫球蛋白之間的分離），則柱體積應(yīng)大于樣品體積25-100倍，高與直徑的比例應(yīng)為20:1-100:1。4、Sephadex凝膠裝柱時(shí)，應(yīng)灌制均勻無(wú)斷層和氣泡。在整個(gè)操作過(guò)程中，凝膠應(yīng)始終保持在液面以下。5、提取的IgM濃度過(guò)低或反復(fù)凍融會(huì)引起變

26、性，應(yīng)分裝后在-70C或-20C凍存，或者加0.2g/L疊氮鈉在4C可保存數(shù)月。6、如無(wú)合用的部分收集器，可手工收集1-2ml/管，用分光光度計(jì)測(cè)定各管吸光度值。參考文獻(xiàn)1、 周本正編著 層析技術(shù)及其應(yīng)用 湖北科學(xué)技術(shù)出版社（1992）28-302、 M.Z.阿塔西, C.J.范奧斯, D.R.阿勃索洛姆 主編 鄭昌學(xué),吳安然等譯 分子免疫學(xué) 科學(xué)出版社 (1988) 212-214第六節(jié) 免疫球蛋白G的親和層析純化法（蛋白A或蛋白G法）基本原理蛋白A是金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁(cell wall)(cell wall)成分。蛋白G是G組鏈球菌的細(xì)胞壁(cell wall)(cell wall)

27、成分。這兩種蛋白質(zhì)分子可通過(guò)免疫球蛋白的FC區(qū)和大多數(shù)哺乳動(dòng)物(mammal;mammalian)(mammal;mammalian)的IgG結(jié)合(見(jiàn)表1)。利用基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)技術(shù)，將蛋白A和蛋白G分子中與Fc區(qū)結(jié)合的結(jié)構(gòu)域部分的基因融合，所產(chǎn)生的融合蛋白，則具有更廣泛的IgG結(jié)合特異性。蛋白A、蛋白G或融合蛋白A/G與免疫球蛋白Fc段的結(jié)合性能使它成為可用于IgG分離的、天然的親和配基。將這些配基蛋白結(jié)合到固體支持物上，提供了應(yīng)用親和層析純化抗體的一步法的基礎(chǔ)。試劑及儀器l 含IgG的樣品l PBS(見(jiàn)附錄)l 裝

28、有2ml固相化的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G的小型層析柱(有商品供應(yīng))l 透析袋(MWCO 10,000)l 結(jié)合緩沖液：0.1mol/L Tris-HCl pH7.5 + 0.15mol/L NaCll 分步收集器(可按需要選用)l 洗脫緩沖液:0.1mol/L Gly-HCl pH2.8+0.15mol/L NaCll 中和緩沖液：1mol/L Tris-HCl pH 8.0l 蠕動(dòng)泵(可按需要選用)l UV監(jiān)測(cè)器l pH計(jì)操作步驟* 樣品(可為血清、腹水、含有IgG的單克隆和多克隆抗體的細(xì)胞上清液)。1 樣品在4,對(duì)結(jié)合緩沖液透析過(guò)夜，或?qū)⑵渑c至少1：1稀釋的結(jié)合緩沖液混合；2 如果條件充

29、許，將層析柱與蠕動(dòng)泵、分步收集器和UV監(jiān)測(cè)器相連；3 至少用10ml結(jié)合緩沖液, 以1ml/min速度, 洗滌柱中的2ml親和層析介質(zhì)；4 上樣；5 一旦樣品進(jìn)入凝膠，用結(jié)合緩沖液洗柱（至少10個(gè)柱體積），直至A280nm 小于0.03；6 用洗脫緩沖液洗脫所結(jié)合的IgG,分布收集2ml/管；7 收集過(guò)程中,每管立即加入0.1ml中和緩沖液，以中和洗脫所得的IgG液。8 含IgG的各管對(duì)PBS透析,其后根據(jù)抗體的穩(wěn)定性,加入防腐劑(0.020g/L疊氮鈉)，置4或冷凍保存。實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說(shuō)明通?？赏ㄟ^(guò)SDS-PAGE分析或通過(guò)適當(dāng)?shù)拿庖叻椒?(如Western blot, ELISA等)，對(duì)洗脫組

30、分進(jìn)行純度鑒定和免疫活性測(cè)定。1. 上樣量由層析柱的對(duì)特定免疫球蛋白的容量確定，2ml柱對(duì)于小鼠IgG 的容量約10mg，對(duì)于人IgG的容量約為 18mg；2. 柱上結(jié)合的抗體被洗脫的速度很快, 通常在第一洗脫流份中；3. 下列緩沖液也可用為結(jié)合緩沖液：含0.15mol/L NaCl的50mmol/L硼酸鈉pH8.0,或含0.15mol/L NaCl的0.1 mol/L 磷酸鹽液pH7.5。 高鹽結(jié)合緩沖液（1 mol/L NaCl）可能增加總的柱結(jié)合容量約50%；4. 應(yīng)用pH8.0-9.5的緩沖液作為結(jié)合緩沖液，通常能增加蛋白A對(duì)小鼠IgG的結(jié)合力；5. 對(duì)于蛋白G的層析柱，可用低pH的結(jié)

31、合緩沖液,如pH5.0含0.15 mol/L NaCl的50mmol/L 醋酸緩沖液；6. 對(duì)pH敏感的抗體,需用比較溫和的洗脫液, 如:含0.2mol/L NaCl的0.1mol/LTris-醋酸pH7.7或3mol/L KCl或5.0mol/L KI或3.5mol/L MgCl2；7. 蛋白G也能與IgG的CH1區(qū)結(jié)合,所以不能用于F(ab)2與Fc的分離；8. 如果無(wú)蠕動(dòng)泵和部分收集器可用,也可利用重力進(jìn)行上樣及洗脫,手動(dòng)收集2ml / 管,用分光光度計(jì)測(cè)定280nm的吸光度。參考文獻(xiàn)1. Bjorck,L, And Kronvall,G. (1984) Purification and

32、 some properties of streptococcal protein G, a novel IgG binding reagent. J. Immunol. 133,969-9742. Eliasson,M.,Olsson,A.,Palmcramtz,E.,Wiberg,k.,Inganas,M.,Guss,B.,Lindberg,M., and Ulldh,M.(1988)Chimeric IgG-binding receptor engineered from staphylococcal protin A and streptococcal protein G.J.Biol

33、.Chem.263,4323-4327.（張文利、朱正美）第七節(jié) 應(yīng)用酶解從IgG 制備F( ab)2的方法基本原理本文介紹應(yīng)用胃蛋白酶及菠蘿蛋白酶從IgG 制備F( ab)2的方法。這兩種酶均在免疫球蛋白的絞鏈區(qū)雙硫鍵的下方分解IgG（見(jiàn)圖1），裂解產(chǎn)物為三個(gè)片段，即兩個(gè)相同的Fab段和一個(gè)Fc段，F(xiàn)ab段即抗原結(jié)合片段，含有一條完整的輕鏈和半條重鏈，分子量約50000。首選的酶是胃蛋白酶，它在IgG的絞鏈區(qū)二硫鍵的近 C末端切斷重鏈，生成大、小兩個(gè)片段，大片段為Fab雙體，稱為F( ab) 2，其功能與Fab相同。胃蛋白酶可用于大多數(shù)的小鼠的IgG及IgGa以及大鼠、人和兔的IgG抗體制備

34、F( ab)2，但不能用于小鼠的IgGb抗體。應(yīng)用本法，可通過(guò)HPLC測(cè)定組分的大小來(lái)判定水解的程度。F( ab) 2組分在分子量100000部分洗脫，而IgG則在分子量150000的流分中。由于小鼠IgG抗體抗胃蛋白酶，或使酶水解為較小的肽段，因此可采用菠蘿蛋白酶，或經(jīng)過(guò)預(yù)試來(lái)選擇確定合適的蛋白酶。圖2-7-1 IgG不同蛋白酶水解部位示意圖試劑及儀器l 0.2mol/L TE8: 0.2mol/L Tris-HCl pH8.0 + 10mmol/L EDTA，按要求稀釋到20mmol/L TE8l 2mol/L 醋酸, pH3.7： 103ml冰醋酸 + 17.2 克醋酸鈉用蒸餾水配至1L

35、l 70mmol/L 醋酸/ NaCl ，pH4.0：70m mol/L ,50m mol/L ,pH4.0 (22ml 冰醋酸, 1.15克醋酸鈉，2.29克NaCl，用蒸餾水配至1Ll 胃蛋白酶：10mg/ml 胃蛋白酶溶于70m mol/L 醋酸/ NaCl液pH4.0，現(xiàn)用現(xiàn)配l 1 mol/L Tris pH9.2 (121克 Tris堿溶于 1L蒸餾水，以HCl 調(diào)至pH9.2)l 50m mol/L TE7：50m mol/L Tris-HCl pH7.0 + 2 mol/L EDTAl 2-巰基乙醇l 碘乙酰胺儲(chǔ)存液： 50 mmol / L碘乙酰胺液l 50m mol/L T

36、E7碘乙酰胺應(yīng)用液：（加1%體積的碘乙酰胺儲(chǔ)存液到50m mol/L TE7中，現(xiàn)用現(xiàn)配l 菠蘿蛋白酶：10mg/ml 的50m mol/L TE7液，在臨水解前配制。加入2-巰基乙醇至終濃度為0.5mol/L ，在37保溫15分鐘，以使酶活化l 10，000 MWCO濾膜的濃縮裝置l 分級(jí)范圍10000-250000的分子排阻層析 HPLC 系統(tǒng)l 可分離150000蛋白質(zhì)的凝膠過(guò)濾（分子排阻）柱?？捎脙筛睆?.5cm、凝膠床高80cm的柱子*，以30ml/小時(shí)的流速，來(lái)分離10-100mg的IgGl 水浴l 透析帶（10000 MWCO）。用前在含0.1mmol/L EDTA的蒸餾水中煮

37、沸、清洗操作步驟（一） 酶解IgG樣品的用量通常酶解50-200mg IgG ，可生成20-100mg F(ab)2。對(duì)于新抗體，可先用5-15 mg 試做，以確定所用酶對(duì)抗體的水解能力；（二）IgG的濃度及予處理將IgG濃縮到10-15 mg/ml ，為進(jìn)行胃蛋白酶水解，IgG要先對(duì)0.02 mol/L TE8 透析，為進(jìn)行菠蘿蛋白酶水解，IgG要先對(duì)50mmol/LTE7 透析；（三） 胃蛋白酶水解法1 用2 mol/L醋酸（pH 3.7）將抗體液的pH 調(diào)到4.0-4.2，將胃蛋白酶終濃度稀釋到30g/L（W/W）;2 在37水浴中保溫酶解。每次取樣10l 通過(guò)HPLC測(cè)定水解組分的分子

38、大小。在水解過(guò)程中，HPLC測(cè)定的洗脫峰應(yīng)從IgG的單峰變成兩個(gè)峰，分子量小的組分是F(ab) 2。水解通常需要6-12小時(shí)；3 當(dāng)水解到IgG濃度100g/L， 或F(ab) 2峰的大小不再增加時(shí)，加入1 mol/L Tris （pH 9.0），調(diào)節(jié)反應(yīng)液到pH 8.0，以終止反應(yīng)。（四）菠蘿蛋白酶水解法1 向抗體溶液中加入已活化的菠蘿蛋白酶液，達(dá)到需要的濃度。對(duì)不同抗體，所需的酶濃度要先用預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，一般的酶濃度在5-40g/L (W/W)之間；2 反應(yīng)過(guò)程中，同胃蛋白酶水解法一樣，用HPLC來(lái)監(jiān)測(cè)水解的程度；3 當(dāng)水解到IgG濃度100g/L ，或F(ab)峰的大小不再增加時(shí)，加入碘乙

39、酸至終濃度0.5m mol/L ，終止反應(yīng)。（五）產(chǎn)物F(ab) 2的分離1 用經(jīng)過(guò)0.2 mol/L TE8 平衡的凝膠過(guò)濾柱，按分子量大小來(lái)分離水解組分;2 分離后，將分子量100000的F(ab) 2 峰合并、濃縮.圖 2-7-2 產(chǎn)物F(ab) 2 與IgG的分離實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說(shuō)明1 胃蛋白酶的活性對(duì)pH高度敏感，在最適pH范圍外，pH下降其活性會(huì)明顯增加，pH上升，其活性則會(huì)明顯下降；2大多數(shù)的IgG1的水解需6-12小時(shí)。也可將水解液置4水解過(guò)夜。小鼠IgG3 很難被酶解消化成F(ab) 2；3 當(dāng)需要完全不含IgG 或Fc段的F(ab) 2時(shí)，水解產(chǎn)物還需通過(guò)抗- Fc免疫吸附柱純化

40、（請(qǐng)參閱參考文獻(xiàn)1），或通過(guò)蛋白A-瓊脂糖柱純化；4 水解的程度也可通過(guò)非還原性的.SDS-PAGE與考馬氏藍(lán)染色來(lái)測(cè)定。參考文獻(xiàn) Glennie, MJ., Tutt, AL. And Greenman, J. (1993) Preparation of multispecific F(ab)2 and F(ab)3 antibody derivatives. In Tumor Immuology. A Pratical Approch (eds. Gallagher, G., Rees, RC. And Reynolds, CW.). pp.225-244. Oxoford Univers

41、ity Press.2. Lamoyi, E. And Nisonoff, A. (1983) Preparation of F(ab)2 fragmentsFrom mouse IgG of various subclasses. J. Immunol. Meth. 56, 235-243.（朱正美）第八節(jié) 從F(ab)2制備Fab基本原理在F(ab)2絞鏈區(qū)的雙硫鍵可用巰基乙醇使之還原，得到具有游離SH基的Fab，隨后可用碘乙酸使Fab的游離SH基烷基化，從而防止其再氧化生成F(ab)2。試劑與設(shè)備l 0.2 mol/L TE8: 0.2 mol/L Tris-HCl, pH 8.0 +

42、10m mol/L EDTAl 2-ME 還原溶液：220mmol/L 2-巰基乙醇mmol/L EDTA （在通風(fēng)櫥中配置此溶液 ）l 250mmol/L 碘乙酸: 250mmol/L 碘乙酸儲(chǔ)存液l HPLC系統(tǒng)及凝膠過(guò)濾柱（同前）l 透析袋。經(jīng)過(guò)在含 0.1mmol/L EDTA水中煮沸及沖洗操作步驟1. F(ab)2的濃縮：將所得的F(ab)2液濃縮到0.5-15mg/ml 范圍；2. 還原：（1） 向F(ab)2液中加入1/10 體積的2-巰基乙醇還原液（終濃度為20m mol/L 2-巰基乙醇）；（2） 在25水浴中保溫30分鐘；（3） 加入1/10 體積的250m mol/L 碘

43、乙酸，以封閉游離的SH基；（4） 在25水浴中保溫10分鐘；（5） 用HPLC分析法，通過(guò)比較F(ab)2原液與還原生成的Fab的量，來(lái)檢測(cè)還原度。Fab在F(ab)2之后被洗脫，使得洗脫的峰形改變（見(jiàn)圖1）。Fab的分子量為50000；（6） 在大多數(shù)的情況下，大于950g/L的F(ab)2被還原為Fab。3. Fab產(chǎn)物的分離：（1） 如果在制備液中僅存在少量的未還原的F(ab)2，是符合實(shí)驗(yàn)需要的，殘余的2-巰基乙醇和碘乙酸可通過(guò)對(duì)緩沖液透析以除去；（2） 如果還原不夠充分，或需要Fab完全與未還原的F(ab)2分離，則可在0.2 mol/L TE8液中通過(guò)凝膠過(guò)濾法進(jìn)行分離，合并、濃縮

44、分子量為50000的Fab峰。圖2-7-4 Fab產(chǎn)物與F(ab)2的分離（圖240）實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說(shuō)明1. 上述操作也會(huì)使IgG的部分重鏈雙硫鍵還原，但因非共價(jià)相互作用還可維持重鏈與輕鏈的連系，故不影響Fab段與重鏈的結(jié)合性能。然而，在非還原性SDS-PAGE分析圖譜中，則可看到完整的Fab（分子量大約50000Da）及輕鏈（大約25000Da）兩條條帶；2. 可用100g/L的非還原性SDS-PAGE，來(lái)檢測(cè)反應(yīng)液中F(ab)2的還原程度。F(ab)2條帶約分子量100000Da，F(xiàn)ab在50000 Da，而已還原的重鏈及輕鏈分子量為25000 Da ，條帶容易分辨。參考讀物Glennie,

45、MJ., McBride, HW,. Worth, AT. And Stevenson, GT. (1987) Preparation and performance of bispecific F(ab)2 antibody containing thioether-linked Fab fragments. J. Immunol. 139, 2367-2375.第九節(jié) 免疫球蛋白A 純化基本原理免疫球蛋白A（IgA）可由多種組織和器官產(chǎn)生，如粘膜，骨髓，淋巴結(jié)等。血中IgA以單體或聚合體形式存在，含量約為21080mg，骨髓瘤病人血清中IgA水平增加。 IgA分IgA1和IgA2兩種亞型，

46、其中IgA1亞型占總IgA的90%以上，并在鉸鏈區(qū)結(jié)合有特征性的O連接寡糖鏈。（見(jiàn)第六篇，第二章）。實(shí)驗(yàn)中常需對(duì)總IgA及IgA1亞型進(jìn)行分離、純化和鑒定。IgA純品價(jià)格昂貴，如能自己制備，則可節(jié)省資金。一、IgA的抗體親和層析分離原理利用IgA抗體對(duì)IgA抗原的特異結(jié)合特性。溴化氰活化的Sepharose-4B凝膠與多克隆抗IgA抗體，或抗IgA1亞型單抗共價(jià)交聯(lián)制備親和層析柱。經(jīng)親和柱分離，即可得到總IgA或IgA1亞型純品。試劑和儀器l 多克隆抗IgA抗體，或抗IgA1亞型單抗l 抗體Sepharose-4B偶聯(lián)膠：制備過(guò)程參見(jiàn)（第二篇，第一章），或購(gòu)買(mǎi)成品膠l 0.22M微孔濾膜l 層析柱l 0.01mol/L硼酸鈉，pH 8.0l 0.25mol/L甘氨酸鹽酸緩沖液，pH 2.7l Tris-HCl緩沖液，pH 8.0l PBS緩沖液l 保存液：含0.02% NaN3 的0.01mol/L硼酸鈉，pH 8.0l 試管l 紫外分光光度儀l 離心機(jī)操作步驟1. 收集5ml血清，27,000g，4離心30min。上清經(jīng)0.22M