馬鈴薯y病毒外殼蛋白基因表達(dá)效率影響因素的研究

1、 2005年第40卷第2期 生物學(xué)通報(bào)49馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因表達(dá)效率影響因素的研究半 楊立昌乙引(貴州師范大學(xué)生物技術(shù)與工程學(xué)院 貴卅l貴陽 550001)馬鈴薯Y病毒(PVY)屬病毒大多以經(jīng)濟(jì)作物為寄多因素影響，本研究選擇細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間、表達(dá)誘導(dǎo)時(shí)問、通氣量、培養(yǎng)基成分以及抗生素等幾個(gè)因素探討 其對PVY外殼蛋白基因工程菌表達(dá)效率的影響： 主，是農(nóng)作物、牧草、園藝和香料作物的主要病害，極大o。通常，對該屬病毒的鑒定和檢測使用ELISA法? 但由于病毒制備工作繁瑣，不易得到很好的抗血清， 至使該法不能廣泛使用。目前，已有研究表明PVY外殼蛋白具有種屬專一性，是該病毒屬鑒定和檢測的極為有用的

2、指標(biāo)【2 J。通過基因工程生產(chǎn)的PVY外殼蛋白，可以作為制備該病毒屬抗血清的最有效抗體。 本課題組已經(jīng)成功地通過基因工程技術(shù)得到了含有馬鈴薯Y病毒外殼蛋白基因的pET30aBL21工程菌，并實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。為了探索最佳的表達(dá)條件，我們研究了幾種主要因素對PVY CP基因表達(dá)效率的影響，以期為PVY外殼蛋白、馬鈴薯Y病毒屬特異性抗 血清的大量制備以及檢疫試劑盒的研制打下基礎(chǔ)。 為了了21轉(zhuǎn)基因工程菌pET30aBL21的生長曲線 解工程菌pET30aBL21的生長繁殖情況，測定了pET30aBL21在2xYT培養(yǎng)液中的生長曲線：結(jié)果表明 (下圖)轉(zhuǎn)基因工程菌pET30aBL21從開始培養(yǎng)到90 mi

3、n為細(xì)菌生長的遲，從90200 rain為對數(shù)期，200 rain 之后進(jìn)入細(xì)菌生長穩(wěn)定期。 材料與方法實(shí)驗(yàn)材料 1)菌株與表達(dá)載體 111菌株為BL21，表達(dá)載體為時(shí) I 司 (min) pET30aBL21的生長曲線 pET30a。 2)主要試劑 IWG誘導(dǎo)劑和DNA分子量marker 由美國Sigma公司生產(chǎn)；其他藥品均為國產(chǎn)分析純試 劑 。 12細(xì)菌培養(yǎng)與基因表達(dá)將儲存于一20的帶有轉(zhuǎn) 工程菌培養(yǎng)時(shí)間對表達(dá)效率的影響細(xì)菌一般22在對數(shù)期生長旺盛，對外界刺激敏感，能很好地表現(xiàn) 出細(xì)胞功能。表l說明在不同細(xì)菌生長期IPTG誘導(dǎo) CP基因表達(dá)的效率存在差異?在細(xì)菌培養(yǎng)1hPVY后進(jìn)行誘導(dǎo)，P

4、VY CP基因的表達(dá)效率為285，而培養(yǎng)2 h后誘導(dǎo)，表達(dá)效率為456，達(dá)到最高值，之后， 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，表達(dá)效率呈下降趨勢當(dāng)培養(yǎng) 基因pET30a質(zhì)粒的BL21菌株接種到2xYT固體培養(yǎng) 基上，培養(yǎng)箱中37活化培養(yǎng)1224 h，待長出菌落 后接種到2xYT液體培養(yǎng)基中，35振蕩培養(yǎng)4 h。取h后誘導(dǎo)，表達(dá)效率穩(wěn)定在36左右二因此為了獲 3mL培養(yǎng)基100L pET30aBL21培養(yǎng)物分別接種于2得高效表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)應(yīng)選擇在對數(shù)生長前期為宜 表1 培養(yǎng)時(shí)間對PVY cP基因表達(dá)效率的影響 中，振蕩培養(yǎng)2 h，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。所有培養(yǎng)基的配制參見盧圣棟的方法。 培養(yǎng)時(shí)間(h) l23

5、46電泳分析SDS一聚丙烯酰胺凝膠電泳對表達(dá)產(chǎn) 13表達(dá)效率() 285-+087 456098 368+097 363094 354+093 物進(jìn)行分析。分離膠和濃縮膠濃度分別為12和5。考馬斯亮藍(lán)染色，甲醇醋酸溶液脫色。 14表達(dá)效率的測定 用島津CS一910掃描儀對細(xì) 22誘導(dǎo)時(shí)間對表達(dá)效率的影響PVY CP基因的表達(dá)是一個(gè)逐漸積累的過程，IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的長短直接影響到CP基因的表達(dá)效率。表2表明，在誘導(dǎo)開始 階段，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，表達(dá)效率也隨之提高，并在3 h時(shí)達(dá)到最大值，為514。繼續(xù)延長誘導(dǎo)時(shí)間后，表達(dá)效率出現(xiàn)下降趨勢。由此推測基因表達(dá)的誘 導(dǎo)過程可分為兩個(gè)階段，在誘導(dǎo)前期，

6、細(xì)胞生長受到抑制，大量的有機(jī)物用于合成外殼蛋白；當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入誘導(dǎo)期后，IPTG對細(xì)胞生長的作用減弱，導(dǎo)致細(xì)胞生長 逐步恢復(fù)，同時(shí)，合成外殼蛋白的速度減少，其結(jié)果造 成表達(dá)效率下降。 CP基因菌全蛋白SDSPAGE膠進(jìn)行薄層掃描，PVY電泳譜帶的相對峰面積即為該基因的表達(dá)效率。2結(jié)果與討論 馬鈴薯Y病毒屬是47 個(gè)植物病毒屬中病毒種類最多的屬121，其外殼蛋白分子量30x10347103，N一末端含有病毒專一性的表面抗原決定簇，而外殼蛋白的中心區(qū)域具有很高的氨基酸順序保守性，是該病毒屬鑒定和檢 測的極為有用的指標(biāo)1451。 PVY外殼蛋白基因工程菌的獲得有效地解決了EUSA法中抗原制備問題。由于基

7、因的高效表達(dá)受諸4基金萬項(xiàng)方目：數(shù)貴據(jù)州省優(yōu)秀科技教育人才省長基金項(xiàng)目(200104) 2QQj生箜蘭Q鲞箜2塑 !Q生塑堂適握 表2誘導(dǎo)時(shí)間對表達(dá)效率的影響 的培養(yǎng)基中生長。我們測定了在50 txgmL氯霉素存在的情況下，Kana對CP基因表達(dá)效率的影響(表5)， 結(jié)果表明：在0100 txgmL濃度范圍內(nèi)，隨著Kana濃 度的增加，CP基因的表達(dá)效率呈現(xiàn)由升高到下降的 誘導(dǎo)時(shí)間(h) 3Ol24表達(dá)效率()203078 431O91 514101 4750980表3通氣量對表達(dá)效率的影響 趨勢，其最大值出現(xiàn)在25Kana濃度。由此可 IxgmL通氣量(mL)6090】10460見， 不僅抗

8、生素對抗生素基因缺陷型細(xì)胞具有摧毀作用，高濃度抗生素對抗生素基因非缺陷型細(xì)胞也具有 一定的抑制作用，造成表達(dá)效率的減少。 表5抗生素濃度對表達(dá)效率的影響 表達(dá)效率()310069343O72394073526070+培養(yǎng)體積為500 mL 23通氣量對表達(dá)效率的影響 氧氣對于細(xì)菌的呼 100Kana濃度(ggmL)25050吸作用至關(guān)重要。在外殼蛋白誘導(dǎo)過程中，通過改變培養(yǎng)體積，造成不同的通氣量，結(jié)果表明(表3)，PVY CP基因的表達(dá)效率隨著通氣量的增加而明顯上升。2-4培養(yǎng)基成分對表達(dá)效率的影響 雖然大腸桿菌BL21菌株可在多種培養(yǎng)基中生長，但其對營養(yǎng)成分的利用效率不同可能造成CP基因表達(dá)

9、效率的差異。本文研究了3種培養(yǎng)基對該基因工程菌表達(dá)效率的影響(表4)，結(jié)果表明，在2xYT培養(yǎng)基上生長時(shí)具有最大的表達(dá)效率，為514，而SOB和LB的培養(yǎng)基的表達(dá)效率分別為303和265，遠(yuǎn)低于2xYT培養(yǎng)基的效果。2xYT培養(yǎng)基含有較多的胰化蛋白胨，而SOB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中胰化蛋白胨含量相近，因此，推測胰化蛋白胨的含量可能是造成CP基因表達(dá)效率差異的重要原因。 表4培養(yǎng)液對表達(dá)效率的影響 表達(dá)效率()20002520054310432204根據(jù)以上研究結(jié)果，得到有效提高PVY CP表達(dá)效率的途徑如下：誘導(dǎo)時(shí)間應(yīng)選擇對數(shù)生長前期，以誘 導(dǎo)3 h為宜；在誘導(dǎo)過程中應(yīng)盡量增加通氣量；誘導(dǎo)培養(yǎng)基

10、最好使用含25 lxgmlKana的2xYT培養(yǎng)基。參考文獻(xiàn) LESEMANNDECytopathologyIn The plant virusesv014The1Filamentous plant VirusesEdited by RG MileNew YorkLondon：P1enum Press1988：179235 2ofWARD，CW，SHUKLA，DDTaxonomypotyviruses：current some solutionsIntervirology 1991，32：269-296 problems and3盧圣棟現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)北京：高等教育6：365387 ，1

11、995， 4DOMIER，LL，SHAW，JG，RHOADS，REPotyviral proteins share amino acid sequence homology with pieoma-，andeaulimoviral培養(yǎng)液2xYTSOBproteinsVirology 1987，158：20-27 DOUGHERTY。W+G，CARRINGTON，JCExpressionLB5and function 表達(dá)效率()514土106303O44265of potyviral gene productsAnnual Review of 26：123143 1988，phytopatho

12、logy2。5抗生素對表達(dá)效率的影響pET30a質(zhì)粒含有抗 氯霉素和卡那霉素的雙抗基因，可在含這兩種抗生素 (BH)艇c斗棗牛e艇!耳e艇叫電斗皋斗e拍f斗e艇f斗辜*e艇!斗e拍!斗ee斗竄艇!*e艇c斗棗艇c耳e耳e斗e拍!斗e斗g娟!斗e牛e斗e艇c膏棗斗e耳昏斗辜斗e斗e拍!斗e斗棗斗盡棗拍!膏棗 問：新生兒如何從母體獲得免疫力? 淋巴樣組織產(chǎn)生，其中大部分是由胃腸淋巴樣組織所 合成，少部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜組織合成。哺乳期產(chǎn)婦乳腺組織中含有大量IgA產(chǎn)生細(xì)胞， 產(chǎn)生的IgA分為兩種類型：IgAl和IgA2，IgAl主要存 在于血清中，IgA2主要存于外分泌液中，如初乳、唾

13、液、淚液、胃腸液和支氣管分泌液，是粘膜局部免疫的重要因素。IgA在消化道粘膜可以與相應(yīng)病原微生物結(jié)合，阻抑其吸附到易感細(xì)胞上，亦可中和相應(yīng)病毒或細(xì)菌產(chǎn)生的外毒素。產(chǎn)婦可以通過初乳將分泌型的 答：人體能產(chǎn)生5種抗體IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。在個(gè)體發(fā)育過程中，IgM合成最早，在胚胎發(fā)育后期就能夠合成了。IgG是在出生后3個(gè)月開始合成的，IgA 是在出生后46個(gè)月開始合成的，IgD、IgE開始合成的時(shí)間更晚，并且IgD、IgE在Ig中所占比例很小。所以，新生兒出生后3個(gè)月內(nèi)主要依靠從母體得到IgG、IgA以獲得免疫力。 1) 通過胎盤從母體得到IgG IgG主要是由脾和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞

14、合成和分泌的，是唯一可以通過胎盤從母體轉(zhuǎn)移給胎兒的抗體。IgG能選擇性地與胎盤母體一側(cè)的滋養(yǎng)層細(xì)胞結(jié)合，轉(zhuǎn)移到滋養(yǎng)層細(xì)胞的吞飲泡 IgA傳遞給嬰兒，在嬰兒的消化道粘膜上發(fā)揮免疫作用，可以結(jié)合飲食中的大量的可溶性抗原，也可以和腸道正常菌群或病原微生物所產(chǎn)生釋放的熱原性物質(zhì)結(jié)合，防止它們進(jìn)人血液，這也是一種重要的自然 被動免疫。 內(nèi)，并主動外排到胎兒血液循環(huán)中去。IgG通過胎盤的作用是一種重要的自然被動免疫，對于新生兒抗感染有重要的作用。 2) 通過初乳從母體得到IgA IgA主要由粘膜相關(guān) 劉本舉 李新梅 孫淑偉 田衛(wèi)生(濮陽市第一高級中學(xué) 河南濮陽457000) (BH) 馬鈴薯Y病毒外殼蛋白

15、基因表達(dá)效率影響因素的研究 楊立昌， 乙引， Yang Lichang， Yi Yin作者： 作者單位：刊名： 貴州師范大學(xué)生物技術(shù)與工程學(xué)院,貴州,貴陽,550001生物學(xué)通報(bào)BULLETIN OF BIOLOGY英文刊名： 年，卷(期)：2005,40(2)參考文獻(xiàn)(5條) 1.LESEMANN D E;Cytopathology In The plant viruses, vol. 4, The Filamentous plant Viruses 19882.WARD C W;SHUKLA, D. D Taxonomy of potyviruses:current problems and some solutions 19913.盧圣棟 現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 19954.DOMIER L L;SHAW,J.G;RHOADS,R.E Potyviral prot